摘  要 淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中**重要的細(xì)胞，在免疫中起關(guān)鍵作用，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。對人的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析對人類遺傳研究及臨床應(yīng)用有重大意義。每一物種都有一定數(shù)目及一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的染色體，可在顯微鏡下觀察到。本次實(shí)驗(yàn)的目的就是掌握人體微量血液體外培養(yǎng)制備染色體標(biāo)本的方法并學(xué)習(xí)對人的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行核型分析。
每1ml 外周血中一般含有約1～3×10⁶個(gè)小淋巴細(xì)胞， 幾乎都處于G1期或G0期的非增殖狀態(tài) ，一般情況下是不再分裂的。但當(dāng)在培養(yǎng)液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴細(xì)胞受刺激便轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，重新進(jìn)入增殖周期，進(jìn)行有絲分裂。經(jīng)過66～72小時(shí)(三個(gè)周期)的短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得大量的有絲分裂相細(xì)胞，從而進(jìn)行染色體標(biāo)本制備和核型分析。這種微量全血培養(yǎng)技術(shù)已在臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、遺傳毒理學(xué)等方面得到了廣泛應(yīng)用。
本實(shí)驗(yàn)采取了人類的外周血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)各種技術(shù)處理后**后得到較為清晰的人體染色體照片。 通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：人類每個(gè)體細(xì)胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男性是46，XY；女性是46，XX。 根據(jù)染色體的形態(tài)、大小、及著絲粒的位置，將人的外周淋巴細(xì)胞的46條染色體分為A、B、C、D、E、F、G7組共23種類型。
 
關(guān)鍵詞  人的外周血淋巴細(xì)胞  染色體  低滲溶液    核型分析  秋水仙素  動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)
  
Human Peripheral Blood Lymphocyte Culture
 
 
Abstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.
In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro whole blood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.
The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.
 
Key words: Human blood lymphocytes   Chromosome   Low permeability solution   
Karyotype analysis   Autumn daffodils element  zooblast in vitro raise offcenter
 
前  言 
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是目前生命科學(xué)研究*域的一項(xiàng)常用而重要的技術(shù)，它涉及的技術(shù)有：無菌操作技術(shù)、細(xì)胞分離技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、顯微攝影技術(shù)、圖像分析技術(shù)等。
Moorhead和Levan等(1960)建立的人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以及Rothrels等(1958)建立的氣干法制片技術(shù)，成了研究人與哺乳類染色體的**主要技術(shù)。這種取材簡易、用血量少的培養(yǎng)方法已被臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)，遺傳毒理學(xué)等方面廣泛采用。細(xì)胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞在體外長期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，共給細(xì)胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關(guān)的生長因子；氧氣及適宜的溫度；注意調(diào)節(jié)其外環(huán)境的酸堿度（pH）與滲透壓；以及為排除細(xì)胞代謝產(chǎn)物的危害，保持良好適宜的外環(huán)境而進(jìn)行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無菌條件下進(jìn)行。
人們對許多動(dòng)植物的染色體進(jìn)行廣泛研究^【1】，并取得了可喜成果，可對哺乳動(dòng)物及人類染色體研究進(jìn)展不大。其原因在于：1） 不易獲得分裂過程中的細(xì)胞；2）過去的傳統(tǒng)方法多為切片、壓片，對描述染色體結(jié)構(gòu)不準(zhǔn)確，技術(shù)不高；3）人類染色體數(shù)目多，大小不同，彼此重疊。
1912年，Warfter **先研究人類染色體。
1923年，報(bào)道人類染色體的二倍體為48條。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培養(yǎng)人胚組織細(xì)胞，計(jì)數(shù)人體細(xì)胞染色體數(shù)為46條。
1960年，Moorhead建立人體外周血培養(yǎng)技術(shù)，使染色體的研究躍進(jìn)一步。
1968年，T.U. Casperssan提出染色體顯帶技術(shù)。
自1956年Tjio（莊有興）和Levan確定人類染色體數(shù)目為46個(gè)后，在1960年的Denver會(huì)議和1963年的London會(huì)議制定了統(tǒng)一的人類染色體命名體制：按照染色體的相對長度、臂比和著絲粒指數(shù)，將常染色體（22對）按大小用阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)記，順次排列為1～22號(hào)，性染色體用X和Y標(biāo)記；并按染色體大小和著絲粒位置，把人類染色體分為七個(gè)組，用大寫字母A～G表示，把人的46個(gè)染色體分為7個(gè)群#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#^【2】。但對識(shí)別每一個(gè)染色體仍有很大困難，尤以C組更難區(qū)別。1970年，發(fā)現(xiàn)染色體分化染色，并于1971年召開了G際性巴黎會(huì)議，為G、Q、C和R帶四種分帶技術(shù)建立了命名法。以后又逐步建立了Giemsa11分化染色法及染色體脆性位點(diǎn)顯示法。為染色體遺傳病診斷、雜種細(xì)胞檢定、特殊細(xì)胞株標(biāo)記、染色體的識(shí)別等開創(chuàng)了一系列檢測方法，大大加速了染色體研究的進(jìn)展。
細(xì)胞遺傳學(xué)組織培養(yǎng)技術(shù)為人類染色體的研究提供了條件。技術(shù)突破主要在于^【3】[4]：
1）人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和PHA的應(yīng)用。PHA 是從菜豆種子中提取出來的，大量的PHA具有凝血作用。如果適合，可刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)為母細(xì)胞，從而進(jìn)行有絲分裂。
2）秋水仙素的應(yīng)用。秋水仙素可阻斷紡綞體截止于中期，使染色體個(gè)體大，結(jié)構(gòu)清晰，縮短適度，細(xì)胞質(zhì)粘度降低。
3）低滲處理（水或0.075mlKCl）使紅細(xì)胞脹破，白細(xì)胞脹大，染色體空間變大，易伸展,便于觀察。
通過本實(shí)驗(yàn)掌握人體外周血離體培養(yǎng)制備染色體標(biāo)本的方法。人體外周血的形成包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板，其中紅細(xì)胞和血小板不能離體培養(yǎng)，白細(xì)胞中含有小淋巴細(xì)胞。 所謂外周血培養(yǎng)即是將外周血接種在適當(dāng)?shù)呐嗯囵B(yǎng)物中加入適量的秋水仙素，使紡錘體微管解聚，這樣細(xì)胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細(xì)胞。外周血淋巴細(xì)胞是不能增殖的分化細(xì)胞群，在體外無菌培養(yǎng)條件下，若于培養(yǎng)基中植物凝集素(PHA)則可刺激處于G1期或G0期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，重新有絲分裂的能力，經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng)，秋水仙素的處理 ，低滲和固定， 即可獲得大量分裂期細(xì)胞以供染色體分析。秋水仙素可通過干擾微管組裝而抑制紡錘絲形成，使細(xì)胞分裂順利進(jìn)入后期而停滯于中期，從而可在短期內(nèi)積累大量**適于進(jìn)行染色體分中期分裂相^【5】。此外，秋水仙素還能使染色單體縮短、分開，使染色體呈現(xiàn)明顯形而利于辨認(rèn)。
本實(shí)驗(yàn)中采用體外培養(yǎng)和低滲技術(shù)。體外培養(yǎng)的原理是將離體的細(xì)胞放入培養(yǎng)基中進(jìn)行生長繁殖，保持細(xì)胞的生命活力，便以對細(xì)胞進(jìn)行各方面的研究。通過許多學(xué)者的改進(jìn)和革新，培養(yǎng)基由天然的動(dòng)物血漿改為合成培養(yǎng)基，促進(jìn)細(xì)胞生長的物質(zhì)從胎汁改為動(dòng)物血清，本實(shí)驗(yàn)中用的小牛血清。體外培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，微生物制藥技術(shù)，基因轉(zhuǎn)染與細(xì)胞融合以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化工程技術(shù)等方面。低滲處理的目的是使水分通過細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)滲入，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，染色體進(jìn)一步分散而利于分析。同時(shí)，低滲處理還可使紅細(xì)胞質(zhì)膜破裂，經(jīng)后血影浮于上清中被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細(xì)胞，改善了淋巴細(xì)胞的固定質(zhì)量及標(biāo)本質(zhì)量。
1．材料
1.1  材料   人的外周血淋巴細(xì)胞
1.2  藥品             
1.2.1  RPMI1640培養(yǎng)基^[6]，含有20種氨基酸，維生素，生物素，碳水化合物，無機(jī)物。
1.2.2  肝素，作為抗凝劑使用，主要起抗凝血作用。
1.2.3  秋水仙素，作為有絲分裂的阻止劑，它能改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體形成，使細(xì)胞分裂停留在中期。 
1.2.4  植物凝血素（PHA），是淋巴細(xì)胞有絲分裂刺激劑，激活細(xì)胞分裂 。
1.2.5  雙抗：青霉素、鏈霉素為廣譜抗生素，殺菌。
1.2.6  0.9%生理鹽水，維持人的外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。
1.2.7  固定液，甲醇：冰醋酸=3：1使血清蛋白、核蛋白凝固。
1.2.8  姬姆薩染液，Giemsa染色液使染色體染色。
1.2.9  0.1mol/L 磷酸緩沖液(pH7.4～7.6)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。
1.2.10 低滲液：0.075mol/L KCl或蒸餾水。使細(xì)胞脹大，染色體鋪展，輪廓清晰，染色增強(qiáng)。
1.2.11 3.5％NaHCO3溶液，調(diào)節(jié)pH值。
1.2.12 小牛血清，促進(jìn)細(xì)胞繁殖和維持pH值。
1.3 藥品的配制
RPMI“1640”培養(yǎng)基：稱取“1640”粉末1.05克，用100ml的蒸餾水溶解，加入NaHCO₃ 0.11克，吹CO₂氣體校正pH**7.2。
肝素：稱取肝素鈉8毫克，用2ml的生理鹽水溶解，此溶液的濃度為500單位／ml。
秋水仙素：稱取秋水仙素1毫克，用25ml生理鹽水溶解，此溶液的濃度為40微克/毫升。取0.1mL的該溶液加入5毫升的培養(yǎng)物中，其**終濃度為0.8微克/毫升。
植物凝血素(PHA)：取3支加6ml蒸餾水溶解。
青霉素（每瓶80萬單位）：以8ml生理鹽水稀釋，得10萬單位/ml；以160ml生理鹽水稀釋，則得5000單位/ml。取0.1ml加入5ml培養(yǎng)基中，則**終濃度為100單位／ml。
鏈霉素（每瓶100萬單位）：以1ml生理鹽水稀釋，得100萬單位/ml；以200ml生理鹽水稀釋，則得5000單位/ml。取0.1ml加入5ml培養(yǎng)基中，則**終濃度為100單位／ml。
0.9%生理鹽水：稱取氯化鈉2.7克，溶解于300ml的蒸餾水中。
固定液：甲醇:冰醋=3:1配制。
姬姆薩染液：0.5克姬姆薩粉末，加33ml純甘油，在研缽中研細(xì)，放在56℃水浴鍋中保溫90分鐘，再加入33ml甲醇，充分?jǐn)嚢?，用濾紙過濾，收集在棕色細(xì)口瓶中中保存，作為原液。用時(shí)以磷酸緩沖液1∶10稀釋。
0.1mol／L磷酸緩沖液： pH 7.4~7.6
Na₂HPO₄ •12H#p#分頁標(biāo)題#e#_{2#p#分頁標(biāo)題#e#}O    28.8克
KH₂PO₄（無水）       2.67克  
溶解于1000ml雙蒸餾水中。                                         
低滲液：0.075mol/LKCl或蒸餾水。
3.5％NaHCO3溶液：稱取NaHCO₃3.5克，溶解于100ml的蒸餾水中。
1.4 器具   電子天平  移液管  2mL滅菌注射器  試管架  量筒  燒杯  試劑瓶  培養(yǎng)瓶
毛細(xì)吸管 采血針 恒溫培養(yǎng)箱（37℃） 離心機(jī)  離心管  酒精燈  顯微鏡  載玻片
     
2.方法
2.1 培養(yǎng)液的分裝：超凈工作臺(tái)中，用移液管將下列溶液按要求裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)：
       培養(yǎng)液（ RPMI-1640 ）        4mL
小牛血清                     1mL
PHA                         0.2mL
肝素                        0.05mL
雙抗                  濃度為100單位/mL
用3.5％NaHCO₃（無菌）調(diào)pH**7.2。擰緊蓋子，置于0℃條件下保藏。 用前從冰箱中取出放在37℃恒溫鍋中溫育10min。
2.2  采血：用2mL滅菌注射器吸取肝素0.05mL濕潤管壁管壁，用酒精棉在一手指尖消毒，待酒精揮發(fā)后用消過毒的采血針取適量血，用毛細(xì)血管吸取并將血吹培養(yǎng)瓶中，充分搖勻后置37℃±0.5℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
2.3  培養(yǎng)：置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)69h。用蒸餾水
2.4  秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2.5h，在培養(yǎng)液中加入秋水仙素0.1mL，**終濃度為0.8 μg/mL。 
2.5  收集細(xì)胞：將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入潔凈離心管中。
 
2.6  載玻片的冰浴處理：于燒杯中用蒸餾水浸泡載玻片，放到冰箱中備用。
 
2.7  低滲處理: 加入預(yù)溫37℃的5mL 蒸餾水, 用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液, 37℃恒溫箱內(nèi)處理
              20min，使紅細(xì)胞破碎，白細(xì)胞膨脹。
 
2.8  離心：1000r/min ，離心5min, 棄去上清液，收集白細(xì)胞。
 
2.9  固定：固定液為甲醇:醋酸=3:1。每只離心管中加入固定液2mL,片刻后用滴管輕輕沖打成細(xì)胞懸液，在室溫中固定15min后,離心，吸棄上清液,留下白細(xì)胞。
 
2.10  再固定: 加入固定液2 mL，用吸管輕輕打散，室溫中繼續(xù)固定15min。
 
2.11 再離心：1000r/min離心5min, 棄去上清液，留下白細(xì)胞制片。
 
2.12 制懸液：棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液。向離心管中加入固定液0.5mL,用滴管輕輕沖打成細(xì)胞懸液。
 
2.13 滴片：用吸管吸取細(xì)胞懸液自1m高滴在從冰箱中取出的一張干燥潔凈的載玻片上，輕輕吹散，在酒精燈上微微烤干。
 
2.14 染色：用磷酸緩沖液（pH 7.4）稀釋過的姬姆薩染液(1：10）染色20min，倒去染液，用蒸
   餾水輕輕沖洗。
 
2.15 鏡檢：待稍干后，顯微鏡觀察。低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，再在油鏡下觀
         察，選擇染色體清晰，分散度好的細(xì)胞進(jìn)行核型分析。
      
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1結(jié)果：人體外周血淋巴細(xì)胞染色體（46,XY）示意圖 
 
理論上應(yīng)該觀察到的染色體圖:
 
 
                           人體外周血淋巴細(xì)胞染色體圖（４６，XY）
實(shí)驗(yàn)所得染色體圖:
           
人體外周血淋巴細(xì)胞染色體圖（４６，XY）
3.2核型分析
 
3.2.1計(jì)算：
三個(gè)參數(shù)：
        單個(gè)染色體長度×1000
染色體的相對長度＝ —————————————————————
                           22條常染色體長度+1條X染色體長度
 
短臂長度
著絲粒指數(shù) ＝ ————————×100
                     染色體全長#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
 
 
長臂長度（q）
臂比率 ＝ ————————
                 短臂長度（p）
 
3.3.2常規(guī)染色體核型分析 
(1)染色體是遺傳物質(zhì)的載體，存在于分裂間期細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。每一個(gè)體細(xì)胞含有兩組染色體組，一組來自父方，一組來自母方，用2n表示。其中與性別直接有關(guān)的染色體，即性染色體，可以不成對。人類每個(gè)體細(xì)胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男子是46，XY；女子是46，XX。 
(2)染色體在復(fù)制以后，縱向并列的兩個(gè)染色體，往往通過著絲粒連在一起。著絲粒在染色體的位置是固定的。由于著絲粒位置的不同，可以把染色體分成相等或不等的兩臂，造成中間著絲粒，亞中間著絲粒，亞端部著絲粒和端部著絲粒等形態(tài)不同的染色體。此外，有的染色體還含有隨體和次級(jí)縊痕。所有這些染色體的特異性構(gòu)成一個(gè)物種的染色體組型。染色體的核型反映了細(xì)胞中染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的特征。根據(jù)染色體的形態(tài)、大小、及著絲粒的位置，將人的外周血淋巴細(xì)胞的46條染色體分為A、B、C、D、E、F、G 7組共23種類型。每組染色統(tǒng)體形態(tài)大小不同，X染色體歸入C組，Y染色體歸入G組。^［7］本實(shí)驗(yàn)的人外周血淋巴細(xì)胞采于他人（男性）。根據(jù)各組染色體的特征予以分組：
A組：（N01～03）是**大的一組染色體，它們的著絲粒在中部或幾乎在中部；
B組：（N04～05）為兩對大的亞中著絲粒染色體，它們有明顯的長臂和短臂；
C組：（N06～12+X）為中等大小的亞中著絲粒染色體，它們大小相差不多，X染色體大小介于期間，一般難以區(qū)分；
D組：（N013～15）為中等大小的端著絲粒染色體，它們的一個(gè)重要形態(tài)特征是隨體，隨體是一對著色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與短臂之間的區(qū)域很少著色；
E組：（N016～18）為一對中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體和一對近端著絲粒染色體；
F組：（N019～20） 為兩對小的中著絲粒；
G組：（N021～22+Y）為**小的一組端著絲粒染色體，在N021～22的短臂上可見隨體，Y常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，可以識(shí)別。
（3）下圖為人的外周血淋巴細(xì)胞染色體組型分析圖 ：男（46，XY）
       
                       人類的染色體組型分析圖   男（46，XY）
   4.分析與討論
 
4.1培養(yǎng)條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響： 培養(yǎng)液   培養(yǎng)時(shí)間   PHA  pH
  培養(yǎng)液： ①一定范圍內(nèi)培養(yǎng)價(jià)值愈高，轉(zhuǎn)化率相對也較高；
②過酸或過堿都會(huì)影響細(xì)胞生長，**適pH為7.2-7.4 。
     培養(yǎng)時(shí)間: 在一定限度內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間越長，轉(zhuǎn)化率越高。但如果用PHA激發(fā)，培養(yǎng)超過4-5天，轉(zhuǎn)化率反而降低，故通用時(shí)間為72小時(shí)。
      PHA：   G內(nèi)所用PHA一般為粗制品（英文縮寫為PHA—M，含多糖的蛋白質(zhì)成分；精制品PHA—P，純蛋白質(zhì)成分）。在正式實(shí)驗(yàn)前，必須測定所選用產(chǎn)品的**適濃度，即將PHA稀釋成不同濃度，按正式實(shí)驗(yàn)方法檢測同一樣本。PHA濃度太高時(shí)細(xì)胞有毒性，太低不足以刺激T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一般**適濃度為50-200μg/ml。PHA添加很重要，如保存不善，效價(jià)低或數(shù)量不足，則作用差，但濃度過大，紅細(xì)胞凝塊，這些都會(huì)影響細(xì)胞生長。
pH:  不適于細(xì)胞生長的環(huán)境
 
4.2染色體標(biāo)本制備過程中有兩個(gè)重要環(huán)節(jié)，其原理是：
(1)低滲處理：目的是使水分通過細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)滲入，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，染色體進(jìn)一步分散而利于分析。同時(shí)，低滲處理還可使紅細(xì)胞質(zhì)膜破裂，經(jīng)后血影浮于上清中被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細(xì)胞，改善了淋巴細(xì)胞的固定質(zhì)量及標(biāo)本質(zhì)量。
(2)固定：目的在于盡快使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)固定于接近存活的狀態(tài)，以便作進(jìn)一步處理，若不固定則可因細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。染色體研究中常用固定液為甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸滲透力強(qiáng)，固定迅速，但易使組織膨脹而甲醇則可使組織收縮，兩者混合使用能抵消各自的缺點(diǎn)，得到較好的固定效果。固定液純度要高，臨用時(shí)新鮮配制，應(yīng)沿管壁慢慢加入后打勻，如果固定液加入太快，會(huì)使固定作用過強(qiáng)，染色體扭轉(zhuǎn)；固定液作用不足，染色體出現(xiàn)毛刷狀。
 
4.3染色體標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因。如果淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明培養(yǎng)物生長發(fā)育良好，但制成的標(biāo)本質(zhì)量不佳時(shí)，其原因可能為：
（1）秋水仙素處理不當(dāng)：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時(shí)間有一定的關(guān)系，如果處理時(shí)間太短，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少，相反，如果處理時(shí)間太長，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。
（2）低滲處理不當(dāng)：低滲處理細(xì)胞時(shí)間過長，細(xì)胞膜往往過早破裂，以致分裂細(xì)胞或染色體丟失；如果處理時(shí)間不足時(shí)，細(xì)胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)分析。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
（3）離心速度不合適：如果從培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞后進(jìn)行離心時(shí)的速度太低，細(xì)胞可能被丟失；如果細(xì) 胞被低滲后離心速度過高，往往使分裂細(xì)胞過早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標(biāo)本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。
（4）標(biāo)本固定不充分：如固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時(shí)染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細(xì)胞漿的藍(lán)色背景。
（5）載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在載玻片上的細(xì)胞懸液不能均勻分散，且細(xì)胞隨液體流動(dòng)而丟失。
（6）載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從冰水中拿出時(shí)，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無此現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞難以貼附在載玻片上。
（7） 血樣不同實(shí)驗(yàn)效果有異，據(jù)觀察采血后三周，染色體效果**佳?？赡苁茄獦拥牟町愐约坝^察時(shí)間影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（8） PHA添加很重要，如保存不善，效價(jià)低或數(shù)量不足，則作用差，但濃度過大，紅細(xì)胞凝塊，這些都會(huì)影響細(xì)胞生長。
（9） 在培養(yǎng)中成敗的關(guān)鍵，除了**為重要的PHA的效價(jià)外，培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)液的酸堿度也十分重要。人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)**適溫度為37±0.5℃。培養(yǎng)液的**適pH7.2—7.4。
（10）培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續(xù)放回37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
（11）制片過程中，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膨脹得不大，細(xì)胞膜沒有破裂，染色體聚集一團(tuán)伸展不開，可將固定時(shí)間延長數(shù)小時(shí)或過夜。
（12）無菌操作是培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，采血時(shí)要注意無菌操作，試劑配置要進(jìn)行無菌過濾，所用培養(yǎng)器械要進(jìn)行滅菌處理。
（13）細(xì)胞太多或太少亦能影響分裂相的多少，及標(biāo)本質(zhì)量。
 
4.4核型圖中染色體有的變粗，而有的很細(xì)小。造成這種結(jié)果的原因可能是秋水仙素處理不徹底，一部分染色體加倍，而一部分沒有。
 
5. 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
 
（1）載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。
（2）人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的**適溫度是36.5℃～37.5℃，培養(yǎng)液的**適pH是7.2～7.4。
（3）培養(yǎng)過程中如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續(xù)在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。 
（4）制片過程中，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膨脹的不大，細(xì)胞膜沒有破裂。染色體沒有凝集在一團(tuán)伸展不開，可將固定時(shí)間延長數(shù)小時(shí)或過夜。同時(shí)正確的掌握制片技術(shù)。^［8］
（5）秋水仙素的處理，低滲和固定，可獲得大量的有絲分裂細(xì)胞。
（6）低滲處理極為重要，低滲使紅細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞膨脹，低滲處理濃度及時(shí)間要適當(dāng)。低滲后混勻細(xì)胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。低滲不夠，則染色體聚在一起，分散不好。太過，則造成細(xì)胞破碎，染色體丟失。^［9］ 
（7）離心速度太高，細(xì)胞團(tuán)塊不易打散，速度太低，則會(huì)丟失細(xì)胞。
（8）機(jī)械打散細(xì)胞團(tuán)時(shí)，用力要適度，若用力過猛，細(xì)胞易破碎，染色體不完整。
（9）秋水仙素處理時(shí)間過長，分裂細(xì)胞多，染色體短??；反之，則少而細(xì)長。都不宜觀察形態(tài)及計(jì)數(shù)。故秋水仙素的濃度及時(shí)間要準(zhǔn)確掌握。^［10］
（10）培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過冷的溫度對細(xì)胞的影響。
（11）接種的血樣越新鮮越好，**好是在采血后24h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4℃存放，避免保存時(shí)間過久，否則會(huì)影響細(xì)胞的活力。
 
6. 實(shí)驗(yàn)不足及改正
    整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長，操作繁瑣，多環(huán)節(jié)，易受不確定因素干擾。使得實(shí)驗(yàn)過程中仍存在一些問題， 
例如：由于未經(jīng)顯帶且有破碎，試驗(yàn)結(jié)果不是很明顯，并不能從圖得到非常正確的結(jié)論。具體操作中應(yīng)嚴(yán)格按照注意事項(xiàng)要求進(jìn)行。