細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史及其應(yīng)用
 
（一）前言
 
20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細(xì)胞周圍的其他細(xì)胞融合而成的。生物學(xué)家們就這個(gè)問題展開了激烈的爭(zhēng)論。1907年，美G生物學(xué)家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長(zhǎng)出了神經(jīng)纖維。哈里森的實(shí)驗(yàn)不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動(dòng)物組織培養(yǎng)不斷改進(jìn)并逐漸發(fā)展成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。
所謂動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(亦稱組織培養(yǎng))既有別于植物細(xì)胞培養(yǎng)，又與微生物的培養(yǎng)完全不同。所謂動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指離散的動(dòng)物活細(xì)胞在體外人工條件下的生長(zhǎng)、增殖過程，在此過程中細(xì)胞不再形成組織。
由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是在人工條件下進(jìn)行的，便于調(diào)控和觀察，因而成為現(xiàn)今研究動(dòng)物的物質(zhì)代謝過程、染色體的形態(tài)變化、以及遺傳物質(zhì)的表達(dá)調(diào)控等高難*域的既便利而又有效的新方法。同時(shí)，隨著現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)也在許多應(yīng)用*域充分展示了其巨大的發(fā)展?jié)摿?，并已為世人所關(guān)注。盡管如此，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)仍是一門年輕的新學(xué)科，在發(fā)展之初被混淆于動(dòng)物組織培養(yǎng)之中。
 
（二）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其歷史
 
細(xì)胞培養(yǎng)的歷史**早可追溯到19 世紀(jì)末，據(jù)可考證的資料記載Wilhelm Roux是**個(gè)進(jìn)行動(dòng)物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的人。
1885年Wilhelm Roux 將雞胚髓板放置于溫?zé)猁}水中使之維持存活了數(shù)天，是有記錄的**個(gè)體外移植成功的例子。
1887年Arnold把愷木的木髓碎片接種到蛙的身上。當(dāng)白細(xì)胞侵入這些木髓碎片后，他把這些白細(xì)胞收集在盛將鹽水的小碟中，接下來觀察到這些白細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)，并存活了一個(gè)短的時(shí)間。
    1903年，Jolly將蠑螈的白細(xì)胞保存在懸滴并維持了十個(gè)月。
    1906年，Beebe和Ewing在動(dòng)物的血液中嘗試培養(yǎng)了傳染性巴肉瘤的細(xì)胞。
可是，由于當(dāng)時(shí)的培養(yǎng)基并不理想，因此實(shí)驗(yàn)難以重復(fù)，并且也難以證明這些先軀者所培養(yǎng)的是否是真正存活的健康的組織和細(xì)胞。結(jié)果都和Welhelm ，一樣只能維持離體細(xì)胞的短期存活,而沒有細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
直到1907年，美G胚胎學(xué)家Ross Harrison的實(shí)驗(yàn)才被公認(rèn)為組織培養(yǎng)真正開始的標(biāo)志，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)但提供了可重復(fù)的技術(shù)，而且證明了生物組織的功能可以在體外十分明確地延續(xù)下去。Ross Harrison將蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織在體外不但存活了若干星期，而且居然還從細(xì)胞中長(zhǎng)出了軸突(神經(jīng)纖維)， 解決了當(dāng)時(shí)關(guān)于軸突起源的爭(zhēng)論，并表明了利用體外存活的組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的可能性。他所采用的把培養(yǎng)物放在蓋玻分上并倒置于凹玻片腔中的方法還一直沿用**今，稱為蓋片復(fù)蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法 。
在此基礎(chǔ)上，1912年Carrel 則更加豐富和完善了此項(xiàng)技術(shù)，他將無菌操作技術(shù)引入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，在沒有使用抗菌素的條件下使雞胚心臟細(xì)胞在人工培養(yǎng)條件下生存了34年，并且先后傳代3400次。并發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體液中存在著對(duì)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)有強(qiáng)烈促進(jìn)作用的生長(zhǎng)因子。這一結(jié)論早已被現(xiàn)在的研究所證實(shí)，并成為無血清培養(yǎng)基研究的基礎(chǔ)。由于這兩個(gè)人的**成就，細(xì)胞培養(yǎng)從此開始了迅猛的發(fā)展，并成為生物工程特別是細(xì)胞工程中一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)技術(shù).
1912年，當(dāng)時(shí)的Carrel是外科醫(yī)生，在實(shí)驗(yàn)中特別注意無菌操作。他用血漿包埋組織塊外加胎汁的培養(yǎng)法，并采用了更新培養(yǎng)基和分離組織的傳代措施，從而完善了經(jīng)典的懸滴培養(yǎng)法（Suspension Culture）。Carrel用這種方法，曾培養(yǎng)一雞胚心肌組織長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久。這些創(chuàng)造性的工作充分揭示：離體的動(dòng)物組織在培養(yǎng)條件下，具有近于無限的生長(zhǎng)和繁殖能力；并充分證明組織培養(yǎng)的確是研究活組織和細(xì)胞的極好方法。
1924年Maximow又把Carrel的懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，使之更易于傳代和減少污染。Carrel又設(shè)計(jì)了用卡氏瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織的生存空間。自懸滴培養(yǎng)問世后的30年中，以Harrlson和Carrel為shou的科學(xué)家們，用這些方法對(duì)各種組織在體外生長(zhǎng)的規(guī)律和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了深入的研究，發(fā)表了大量論文，為組織培養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展奠定了鞏固的基礎(chǔ)。
 
（三）動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法
 
（1）貼壁培養(yǎng)法
大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長(zhǎng)，并**終在附著表面擴(kuò)展成單層。其基本操作過程是：先將采集到的活體動(dòng)物組織在無菌條件下采用物理(機(jī)械分散法) 或化學(xué)(酶消化法) 的方法分散成細(xì)胞懸液，經(jīng)過濾、離心、純化、漂洗后接種到加有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(瓶、板) 中，再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。用此法培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)良好且易于觀察，適于實(shí)驗(yàn)室研究。但貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞有接觸抑制的特性，一旦細(xì)胞形成單層,生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，細(xì)胞產(chǎn)量有限。如要繼續(xù)培養(yǎng)還需將已形成單層的細(xì)胞再分散，稀釋后重新接種，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
（2）懸浮培養(yǎng)#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于懸浮生長(zhǎng)型，這些細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)不需要附著物，懸浮于培養(yǎng)液中即可良好生長(zhǎng)，如淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡(jiǎn)便。培養(yǎng)時(shí)只需將采集到的活體動(dòng)物組織經(jīng)分散、過濾、純化、漂洗后，按一定密度接種于適宜培養(yǎng)液中，置于特定的培養(yǎng)條件下即可良好生長(zhǎng)。傳代時(shí)不需要再分散，只需按比例稀釋后即可繼續(xù)培養(yǎng)。此法細(xì)胞增殖快、產(chǎn)量高、培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單，是大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的理想模式。但在動(dòng)物體中只有少數(shù)種類的細(xì)胞適于懸浮培養(yǎng)。
③ 大規(guī)模培養(yǎng)法
動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上融合了固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)罐技術(shù)以及人工灌流和溫和攪拌系統(tǒng)等技術(shù)后發(fā)展起來的。始于20 世紀(jì)60 年代初Capstick 及其同事為生產(chǎn)FMD 疫苗而對(duì)BHK 細(xì)胞的研究。其后，隨著生物技術(shù)產(chǎn)品倍受世人親睞，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)也隨之得到了迅猛發(fā)展，并形成了幾種比較成熟且有應(yīng)用價(jià)值的大規(guī)模培養(yǎng)方法。
① 空心纖維法：空心纖維培養(yǎng)法是Richard kncazek 等在1972 年創(chuàng)建的。**初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性濾膜，外徑約為1/3～3/4mm ，表面具有海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，既能使水分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體透過，也能使細(xì)胞在上面貼附生長(zhǎng)。這種培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分是由3～6層這樣的空心纖維組成的，培養(yǎng)時(shí)將待培養(yǎng)細(xì)胞接種于空心纖維的外腔，培養(yǎng)一段時(shí)間后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到107-107個(gè)/ml時(shí)逐漸用無血清培養(yǎng)液代替含血清培養(yǎng)液。此時(shí)細(xì)胞雖不再增殖，但能正常生活并繼續(xù)分泌所需的蛋白質(zhì)或其他生物制品。由于這種培養(yǎng)方法在分離和純化分泌物時(shí)很方便，因而在生產(chǎn)激素和單抗時(shí)被廣泛應(yīng)用。并相繼開發(fā)出了由硅膠、聚砜、聚丙烯等材料構(gòu)建的新的空心纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。
② 微載體法：微栽體法是Wezel 在1967 年shou先創(chuàng)建的。所采用的微栽體是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固體小珠，其直徑約在50 微米到數(shù)百微米之間。培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)先將微載體在血清中浸泡一下(可加快細(xì)胞與微載體的貼附速度) ，然后將制備好的細(xì)胞懸液和微載體混合孵育一段時(shí)間，待細(xì)胞貼附于微載體上后再轉(zhuǎn)移**培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并借助溫和攪拌系統(tǒng)使細(xì)胞隨載體均勻懸浮于培養(yǎng)液中。這樣細(xì)胞就能夠在微載體表面迅速生長(zhǎng)、增殖，細(xì)胞濃度可高達(dá)107個(gè)/ml 。微載體法是一種完全將貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)融為一體的培養(yǎng)方法。因而不但能使細(xì)胞均勻分布，提高了對(duì)培養(yǎng)液和培養(yǎng)空間的利用，而且適于各種細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，收獲過程簡(jiǎn)單，放大生產(chǎn)也很容易。因而是一種比較理想的大規(guī)模培養(yǎng)方法。只是此法對(duì)微載體的要求較高。
③ 微囊法: 微囊法是美GDamon Biotech 公司創(chuàng)建的一種比較理想的大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法。其基本技術(shù)是：先將欲培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞懸浮于海藻酸鈉溶液中，之后使其通過一種成滴裝置(微囊發(fā)生器) 而逐滴滴入CaCl2 溶液中，海藻酸鈉一旦進(jìn)入CaCl2 溶液后即形成半透膜微囊，從而將細(xì)胞封閉在其內(nèi)。然后再將這種包含有細(xì)胞的微囊懸浮于培養(yǎng)液中培養(yǎng)。這樣培養(yǎng)液中的水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可透過半透膜進(jìn)入微囊供應(yīng)給細(xì)胞,細(xì)胞的代謝物也可透過半透膜被排出,而細(xì)胞分泌的大分子物質(zhì)則被阻留而積累與囊內(nèi)。當(dāng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，在細(xì)胞密度達(dá)到107/ml時(shí)即可分離收集微囊，**后破開微囊就能獲得高度純化的大分子產(chǎn)物。
細(xì)胞培養(yǎng)工作中，以下幾個(gè)方面來預(yù)防支原體的污染：
①控制環(huán)境污染；
②嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；
③細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；
④在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。
清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。支原體**有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對(duì)支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細(xì)胞，不會(huì)重新感染支原體。
 
（四）應(yīng) 用
 
（1）在生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用
離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞具有培養(yǎng)條件可人為控制且便于觀察檢測(cè)的特點(diǎn)，因而可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)*域的基礎(chǔ)研究中。在細(xì)胞生物學(xué)上，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可用于研究動(dòng)物的正?；虿±砑?xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)、代謝以及病變等微觀過程。如神經(jīng)細(xì)胞的增殖、突起生長(zhǎng)、相互識(shí)別、刺激傳遞等機(jī)理就是通過進(jìn)行各種神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)才弄清楚的。在遺傳學(xué)研究中，除可用培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行染色體分析外，還可結(jié)合細(xì)胞融合技術(shù)建立細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行遺傳分析和雜交育種；在胚胎工程中通過體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞并進(jìn)行體外受精、胚胎分割和移植已發(fā)展成了一種較成熟的技術(shù)而應(yīng)用于家畜的繁殖生產(chǎn)中。另外，分離和培養(yǎng)具有多潛能性的胚胎干細(xì)胞，還可用于動(dòng)物克隆、細(xì)胞誘導(dǎo)分化、動(dòng)物育種的研究，并可作為基因轉(zhuǎn)移的高效表達(dá)載體；在病毒學(xué)研究中用培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞代替試驗(yàn)動(dòng)物做斑點(diǎn)分析，不僅方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、而且重復(fù)性好。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
（2）在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用
shou先，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可用于遺傳疾病和先天畸型的產(chǎn)前診斷。目前，人們已經(jīng)能夠用羊膜穿刺技術(shù)獲得脫落于羊水中的胎兒細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行染色體分析或甲胎蛋白檢測(cè)即可診斷出胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型，以此可避免先天殘疾兒的誕生?，F(xiàn)在用這種方法已能檢測(cè)出幾十種代謝性遺傳缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，現(xiàn)在的一些科學(xué)研究已能通過染色體對(duì)比分析檢測(cè)出易患癌癥的病人，以便進(jìn)行及早的預(yù)防和治療。在這方面我G的科學(xué)工作者有較突出的研究成果：他們改進(jìn)了淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法，從而使帶有癌基因的人的染色體表現(xiàn)出明顯高于常人的畸變率，這就從細(xì)胞分子水平揭示了癌癥的病理、病因，并為癌癥的早期診斷和預(yù)防提供了科學(xué)依據(jù)。再次，細(xì)胞培養(yǎng)還可用于臨床治療。目前已有將正常骨髓細(xì)胞經(jīng)大量培養(yǎng)后植入患造血障礙癥患者體內(nèi)進(jìn)行治療的報(bào)道。另外，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物大分子制品也可用于治療某些代謝缺陷疾病。
（3）在動(dòng)物育種上的應(yīng)用
目前，由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞雜交技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的創(chuàng)建與相互結(jié)合，使得人們能夠在細(xì)胞水平操作并改變動(dòng)物的基因進(jìn)行遺傳物質(zhì)的重組。這樣就可以按照人類的需要大幅度地改變生物的遺傳組成，從而使新品種的培育在實(shí)驗(yàn)室中即可完成，可大大縮短育種進(jìn)程，且使育種工作更加經(jīng)濟(jì)有效。胚胎干細(xì)胞的研究成果和克隆羊多莉的問世可以說已為動(dòng)物遺傳育種開辟了一條新途徑。
（4）可用于生產(chǎn)大分子生物制品
利用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)大分子生物制品始于上世紀(jì)60 年代,當(dāng)時(shí)是為了滿足生產(chǎn)FMD 疫苗的需要。后來隨著大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的逐漸成熟和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,人們發(fā)現(xiàn)利用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)大分子藥用蛋白比原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)越性。隨著大量**性細(xì)胞株的創(chuàng)建,在商業(yè)利益的刺激下,動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)也迅速發(fā)展起來,并被付之于應(yīng)用。目前，用動(dòng)物細(xì)胞可生產(chǎn)的生物制品有各類疫苗、干擾素、激素、酶、生長(zhǎng)因子、病毒殺蟲劑、單克隆抗體等，其銷售收入已占到世界生物技術(shù)產(chǎn)品的一半以上。我們相信，隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，以后還會(huì)有更多的生物制品被開發(fā)并用于造福人類。
 
 
 
 
 
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展及應(yīng)用
 
（一） 引言
 
近年來，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已從單純的實(shí)驗(yàn)操作擴(kuò)展到生物學(xué)研究和商業(yè)利用的許多方面，成為廣泛采用的技術(shù)手段。許多生物技術(shù)科學(xué)研究和產(chǎn)品的生產(chǎn)都離不開細(xì)胞培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史中，細(xì)胞培養(yǎng)
基的發(fā)展占有很重要的位置。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞培養(yǎng)的重要因素。根據(jù)培養(yǎng)基的來源及成分的明確程度，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展大致可分為3個(gè)階段：天然培養(yǎng)基階段、合成培養(yǎng)基階段、無血清培養(yǎng)基階段。
 
（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展及其應(yīng)用
 
（1） 天然培養(yǎng)基階段 
這一階段是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的**初及摸索階段。此階段早期機(jī)械模擬細(xì)胞的體內(nèi)生存環(huán)境，直接采用某些組織凝塊，生物性液體和組織提取液等作為組織細(xì)胞的培養(yǎng)基為特征。如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液等。據(jù)記載，**早進(jìn)行組織培養(yǎng)的是Roux采用溫生理鹽水培育雞胚組織，使之存活了數(shù)月之久。隨之，美G生物學(xué)家Harrison在無菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基成功的在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達(dá)數(shù)周，創(chuàng)立體外培養(yǎng)方法。后期便開始了對(duì)維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分的研究，并為合成培養(yǎng)基階段的到來打下了基礎(chǔ)。但當(dāng)時(shí)由于條件所限始終沒有穩(wěn)定的發(fā)展起來。
（2） 合成培養(yǎng)基階段
合成培養(yǎng)基是根據(jù)已知細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。研究表明合成培養(yǎng)基由于成分清楚，故可通過改變或調(diào)節(jié)各種成分的種類、數(shù)量和比例，觀察細(xì)胞生物特有的反應(yīng)性變化，測(cè)知細(xì)胞與外界環(huán)境的關(guān)系，了解細(xì)胞生存條件并可誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化等。自從發(fā)現(xiàn)雞胚組織能在輔加各種氨基酸和多肽Locke溶液中存活一段時(shí)間，在含有葡萄糖和麥芽糖的培養(yǎng)液中能存活持久些以來，在隨后時(shí)間里人們?cè)O(shè)計(jì)了許多添加各種輔助成分的培養(yǎng)基。常用合成培養(yǎng)基的種類和特點(diǎn)一般是依據(jù)條件、經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)基的特點(diǎn)選用。目前常用的是MEMEagle、RPMI1640培養(yǎng)液等。jue大多數(shù)細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要在合成培養(yǎng)基中補(bǔ)充一定量的成分不明確的生物性液體或組織提取液才能支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，其中血清因來源豐富且易于保存而成為被**廣泛采用的培養(yǎng)基添加物，**常用的為小牛血清。小牛血清是由很多大小不同生物分子組成的極為復(fù)雜的混合物，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與抑制生長(zhǎng)活性是生理平衡的，它不是一種簡(jiǎn)單的液體，它含有各種血漿蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、無機(jī)物質(zhì)等。血清的營(yíng)養(yǎng)作用是極大的補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液配方的成分，但是血清中所含的成分復(fù)雜。就蛋白質(zhì)而言，血清中所含的蛋白成分不少于150種。這就給動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)造成了諸多不利的因素：①血清非常昂貴，血清的費(fèi)用占到培養(yǎng)基費(fèi)用的50％，致使生產(chǎn)成本大幅度提高。② 血清中含有某些不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性物質(zhì)或抑制物質(zhì)，對(duì)某些細(xì)胞的體外培養(yǎng)有去分化作用。③血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗、細(xì)胞因子、單克隆抗體等下游培養(yǎng)產(chǎn)物的分離純化帶來很大的困難。④ 批次與批次之間血清質(zhì)量的差異會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，**終影響產(chǎn)品質(zhì)量。血清易被支原體和雜質(zhì)污染。也正是由于血清的應(yīng)用存在上述問題才促使人們對(duì)無血清培養(yǎng)基的研究和應(yīng)用日益重視。為了多種理由除去血清中的不確定成分，創(chuàng)造一種完全化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液將是一個(gè)具有巨大進(jìn)展意義的工作。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
（3） 無血清培養(yǎng)基階段 
無血清培養(yǎng)基就是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的問題。由于無血清培養(yǎng)基可以是完全采用已知分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型組分的低蛋白或無蛋白培養(yǎng)基，因而它不僅為研究和闡明細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了有力的工具，而且為現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是細(xì)胞工程的應(yīng)用準(zhǔn)備了更好的條件。1975年，Hayashi等在培養(yǎng)基中用激素代替血清使垂體細(xì)胞株Gh3在無血清介質(zhì)中生長(zhǎng)獲得成功，預(yù)示著無血清培養(yǎng)基的誘人前景。進(jìn)入2O世紀(jì)80年代后，新的無血清培養(yǎng)基不斷問世，人們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長(zhǎng)因子等 砌，不少細(xì)胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長(zhǎng)口”。尤其是CHO、雜交瘤、骨髓瘤細(xì)胞以及BHK細(xì)胞等f 51。某些細(xì)胞在無血清的條件下，其生長(zhǎng)和抗體的產(chǎn)量甚**較有血清培養(yǎng)時(shí)高出數(shù)倍。另外，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用無血清培養(yǎng)基的成功，還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。這些都足以說明動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究和應(yīng)用進(jìn)入了新的時(shí)期。
無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)：
采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大致有如下好處：①可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性；②避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染；③避免血清組分對(duì)試驗(yàn)研究的影響；④有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化；⑤ 可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。
雖然有上述這些好處存在，但無血清培養(yǎng)基也并非**無缺。其不足之處主要表現(xiàn)為細(xì)胞的適用譜極窄，細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中更易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響以及培養(yǎng)基難以保存等，皆不如傳統(tǒng)的添加小牛血清。
無血清培養(yǎng)基的分代：
目前，無血清培養(yǎng)基已進(jìn)入第3代，第l代無血清培養(yǎng)基雖然不合血清，但含有大量的動(dòng)物和植物蛋白如牛血清白蛋白BSA和動(dòng)物的刺激激素等，雖然其總蛋白量明顯低于有血清培養(yǎng)基，但蛋白含量依然很高。因此廠商致力于發(fā)展第2代無血清培養(yǎng)基，其主要特點(diǎn)是完全不用動(dòng)物來源蛋白，稱之為無血清，無動(dòng)物衍生蛋白。它的優(yōu)點(diǎn)是既可降低生產(chǎn)成本，又能加快報(bào)批的速度， 因?yàn)檎幤繁O(jiān)管部門對(duì)產(chǎn)品是否用含無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)相當(dāng)關(guān)注。由于生物工程的要求，第3代無血清培養(yǎng)基近年已出現(xiàn)，即完全沒有蛋白或含量極低，稱之為雙無培養(yǎng)基，即Serum—free，Protein—free培養(yǎng)基。這帶來下述幾個(gè)方面的好處：shou先是因?yàn)榕囵B(yǎng)基全為化學(xué)已知物，因此細(xì)胞培養(yǎng)與生產(chǎn)很容易做到恒定；其次是細(xì)胞分泌的目標(biāo)蛋白的分離純化更為容易；**后是細(xì)胞培養(yǎng)基的成本(指原材料成本，不包括研究開發(fā)費(fèi)用)大為下降，生產(chǎn)中品質(zhì)管理更加容易。早期的無血清培養(yǎng)基其兩個(gè)主要指標(biāo)即細(xì)胞生長(zhǎng)速率和細(xì)胞密度都低于有血清培養(yǎng)基，現(xiàn)在的無血清培養(yǎng)基在上述兩個(gè)指標(biāo)包括蛋白分泌量都不亞于血清培養(yǎng)基，甚**更好。目前預(yù)測(cè)第4代無血清培養(yǎng)基將會(huì)進(jìn)入研究與開發(fā)，這將是一種無血清、無蛋白、又可以高溫消毒的適合于許多種不同細(xì)胞生長(zhǎng)的全能型培養(yǎng)基。
無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用:
近年的實(shí)踐證明，使用無血清培養(yǎng)基在細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞密度及蛋白的表達(dá)水平都不亞于血清培養(yǎng)，甚**在某些方面超過血清培養(yǎng)，而這正是評(píng)價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)基的幾個(gè)重要指標(biāo)。無血清培養(yǎng)基尚存在不足的方面，但其顯著的優(yōu)勢(shì)將使無血清培養(yǎng)技術(shù)逐步取代含血清細(xì)胞培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基已廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)和細(xì)胞工程*域。無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①研究細(xì)胞的分化條件：目前已有許多在含血清的培養(yǎng)基中不能保持原代細(xì)胞分化現(xiàn)象的細(xì)胞系，在無血清培養(yǎng)基中成功地保留著分化能力和分化現(xiàn)象。如人結(jié)腸癌細(xì)胞LIMI1863在無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)下保持著腎臟的轉(zhuǎn)運(yùn)功能；②用于激素、生長(zhǎng)因子和藥物等與細(xì)胞相互作用的研究；③用于從多種細(xì)胞混雜的培養(yǎng)中選擇目的細(xì)胞，通過對(duì)無血清培養(yǎng)基中的某些成分的取舍，可抑制原代組織培養(yǎng)物中非目的細(xì)胞的過度生長(zhǎng)，達(dá)到選擇目的細(xì)胞的目的；④ 腫瘤病理學(xué)和病因?qū)W的研究：如用于研究致癌因子對(duì)細(xì)胞的影響，研究腫瘤細(xì)胞對(duì)可能觸發(fā)正常細(xì)胞終末分化的外周信號(hào)的反應(yīng)能力，或用于研究正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和移行與基底膜信號(hào)的關(guān)系等；⑤用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品。這可以說是無血清培養(yǎng)基**重要的同時(shí)也是**有發(fā)展前景的應(yīng)用*域。一方面是由于無血清培養(yǎng)基的成分明確、質(zhì)量一致、蛋白含量低，因而有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化；另一方面是可通過對(duì)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，使不同的細(xì)胞能各自在**有利其生長(zhǎng)或**有利于表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中持續(xù)高密度培養(yǎng)。
 
(三)展望
 
經(jīng)過幾十年來的研究與實(shí)踐應(yīng)用，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已日趨完善。隨著這一技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，人們還將不斷努力設(shè)計(jì)理想的生物反應(yīng)器以獲得高密度、高活力的細(xì)胞開發(fā)新的無血清培養(yǎng)基，使生物制品更安全，建立細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)，充分利用培養(yǎng)液以降低生產(chǎn)成本等，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將在生物制備和基因工程等*域得到更廣泛的應(yīng)用圈。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
尤其是無血清培養(yǎng)基的發(fā)展更為迅速。無血清培養(yǎng)基具有許多傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基無法比擬的優(yōu)勢(shì)，但還有許多不足之處有待改善。shou先，無血清培養(yǎng)基只能用于一種或少數(shù)幾種細(xì)胞高密度生長(zhǎng)或高水平表達(dá)目的產(chǎn)物，缺少通用性，有待于研究具有廣泛適應(yīng)性的無血清培養(yǎng)基。其次，將無血清培養(yǎng)基與發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，如何將其應(yīng)用于發(fā)酵工程進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)目的產(chǎn)物將有待于繼續(xù)研究與關(guān)注。另外，無血清培養(yǎng)基目前還存在成本高的問題，因而降低其成本的方法值得探索。