1．間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)
體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谂囵B(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長(zhǎng)特征，可分為貼附型生長(zhǎng)細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長(zhǎng)。
間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)：形態(tài)與成纖維細(xì)胞類(lèi)似，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng)，細(xì)胞中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2－3 厘米個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。可看到細(xì)胞成螺旋狀生長(zhǎng)。 
2．干細(xì)胞應(yīng)用與干細(xì)胞調(diào)控
干細(xì)胞的調(diào)控是指給出適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件，對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。 
2.1內(nèi)源性調(diào)控
干細(xì)胞自身有許多調(diào)控因子可對(duì)外界信號(hào)起反應(yīng)從而調(diào)節(jié)其增殖和分化，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞不對(duì)稱分裂的蛋白，控制基因表達(dá)的核因子等。另外，干細(xì)胞在終末分化之前所進(jìn)行的分裂次數(shù)也受到細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子的制約。
（1）胞內(nèi)蛋白對(duì)干細(xì)胞分裂的調(diào)控
干細(xì)胞分裂可能產(chǎn)生新的干細(xì)胞或分化的功能細(xì)胞。這種分化的不對(duì)稱是由于細(xì)胞本身成分的不均等分配和周?chē)h(huán)境的作用造成的。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細(xì)胞骨架成分對(duì)細(xì)胞的發(fā)育非常重要。如在果蠅卵巢中，調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱分裂的是一種稱為收縮體的細(xì)胞器，包含有許多調(diào)節(jié)蛋白，如膜收縮蛋白和細(xì)胞周期素A。收縮體與紡錘體的結(jié)合決定了干細(xì)胞分裂的部位，從而把維持干細(xì)胞性狀所必需的成分保留在子代干細(xì)胞中。
（2）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控
在脊椎動(dòng)物中，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)非常重要。比如在胚胎干細(xì)胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子Oct4 是必需的。Oct4 是一種哺乳動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)表達(dá)的靶基因產(chǎn)物是FGF-4 等生長(zhǎng)因子，能夠通過(guò)生長(zhǎng)因子的旁分泌作用調(diào)節(jié)干細(xì)胞以及周?chē)甜B(yǎng)層的進(jìn)一步分化。Oct4 缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細(xì)胞不能發(fā)育成內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)。另外白血病抑制因子（LIF）對(duì)培養(yǎng)的小鼠ES 細(xì)胞的自我更新有促進(jìn)作用，而對(duì)人的成體干細(xì)胞無(wú)作用，說(shuō)明不同種屬間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是不完全一致的。又如 Tcf/Lef 轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)上皮干細(xì)胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信號(hào)通路的中間介質(zhì)，當(dāng)與β-Catenin 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后，促使角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)并分化為毛囊。 
2.2外源性調(diào)控
除內(nèi)源性調(diào)控外，干細(xì)胞的分化還可受到其周?chē)M織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響。
（1）分泌因子
間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖，分化和存活。有兩類(lèi)因子在不同組織甚**不同種屬中都發(fā)揮重要作用，它們是TGFβ家族和Wnt 信號(hào)通路。比如TGF 家族中**少有兩個(gè)成員能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的分化。**近研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）不僅能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活和分化，還對(duì)精原細(xì)胞的再生和分化有決定作用。GDNF 缺失的小鼠表現(xiàn)為干細(xì)胞數(shù)量的減少，而 GDNF的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致未分化的精原細(xì)胞的累積。Wnts 的作用機(jī)制是通過(guò)阻止β-Catenin 分解從而激活Tcf/Lef 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)干細(xì)胞的分化。比如在線蟲(chóng)卵裂球的分裂中，鄰近細(xì)胞誘導(dǎo)的Wnt 信號(hào)通路能夠控制紡錘體的起始點(diǎn)和內(nèi)胚層的分化。
（2）膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用
有些信號(hào)是通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。β-Catenin 就是一種介導(dǎo)細(xì)胞粘附連接的結(jié)構(gòu)成分。除此之外，穿膜蛋白Notch 及其配體Delta 或Jagged 也對(duì)干細(xì)胞分化有重要影響。在果蠅的感覺(jué)器官前體細(xì)胞，脊椎動(dòng)物的胚胎及成年組織包括視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮、骨骼肌和血液系統(tǒng)中，Notch 信號(hào)都起著非常重要的作用。當(dāng)Notch 與其配體結(jié)合時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖；當(dāng)Notch 活性被抑制時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)入分化程序，發(fā)育為功能細(xì)胞。
（3）整合素（Integrin）與細(xì)胞外基質(zhì)
整合素家族是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的**主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細(xì)胞的非分化增殖提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。比如當(dāng)β1整合素喪失功能時(shí)，上皮干細(xì)胞逃脫了微環(huán)境的制約，分化成角質(zhì)細(xì)胞。此外細(xì)胞外基質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)β1整合素的表達(dá)和激活，從而影響干細(xì)胞的分布和分化方向。 
2.3干細(xì)胞的可塑性
越來(lái)越多的證據(jù)表明，當(dāng)成體干細(xì)胞被移植入受體中，它們表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性。通常情況下，供體的干細(xì)胞在受體中分化為與其組織來(lái)源一致的細(xì)胞。而在某些情況下干細(xì)胞的分化并不遵循這種規(guī)律。1999 年 Goodell 等人分離出小鼠的肌肉干細(xì)胞，體外培養(yǎng) 5 天后，與少量的骨髓間質(zhì)細(xì)胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細(xì)胞會(huì)分化為各種血細(xì)胞系。這種現(xiàn)象被稱為干細(xì)胞的橫向分化（trans-differentiation ）。關(guān)于橫向分化的調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為干細(xì)胞的分化與微環(huán)境密切相關(guān)?？赡艿臋C(jī)制是，干細(xì)胞進(jìn)入新的微環(huán)境后，對(duì)分化信號(hào)的反應(yīng)受到周?chē)谶M(jìn)行分化的細(xì)胞的影響，從而對(duì)新的微環(huán)境中的調(diào)節(jié)信號(hào)做出反應(yīng)。 
3．間充質(zhì)干細(xì)胞MSC生長(zhǎng)過(guò)程
潛伏期→指數(shù)增生期→停滯期
（1）潛伏期(latent phase) 細(xì)胞接種后,先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形，然后細(xì)胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類(lèi), 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢,可達(dá)10-24 小時(shí)或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常10-30分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24-96 小時(shí)或更長(zhǎng), 連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅需6-24 小時(shí)。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
（2）指數(shù)增生期(logarithmic growth phase) 
這是細(xì)胞增殖**旺盛的階段，分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI ）表示，即細(xì)胞群中每1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于 0.1%-0.5% ，原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá)3％－5％。指數(shù)增生期的細(xì)胞活力**好時(shí)期，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)**佳時(shí)期，也是凍存細(xì)胞的**好時(shí)機(jī)。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù) 3－5 天后，隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間減少，**后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細(xì)胞無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（piled   up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。 
（3）停滯期(Stagnate phase) 細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞就會(huì)停止增殖，進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)持平，故也稱平臺(tái)期（Plateau phase）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)。如不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會(huì)因培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會(huì)脫落，嚴(yán)重的會(huì)發(fā)生死亡，因此，應(yīng)及時(shí)傳代。 
4．間充質(zhì)干細(xì)胞MSC培養(yǎng)的合適氣體環(huán)境
干細(xì)胞相關(guān)的培養(yǎng)液都必須在 5％ CO2 的氣體環(huán)境中培養(yǎng)使用。否則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH 值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH 為7.2-7.4，偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。一般情況下，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。 
5．細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇
細(xì)胞培養(yǎng)板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U 型和V 型）；培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根據(jù)材質(zhì)的不同有Terasaki 板和普通細(xì)胞培養(yǎng)板。具體選擇時(shí)根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的類(lèi)型、所需培養(yǎng)體積及不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?nbsp;
（1）平底和圓底（U 型和V 型）培養(yǎng)板的區(qū)別和選擇 
不同形狀的培養(yǎng)板有不同用途。培養(yǎng)細(xì)胞，通常是選用平底的，這樣便于鏡下觀測(cè)、有明確的底面積、細(xì)胞培養(yǎng)液面高度相對(duì)一致。因此做MTT 等實(shí)驗(yàn)時(shí)，無(wú)論是貼壁和懸浮細(xì)胞，一般選用平底板。測(cè)吸光值一定要使用平底的培養(yǎng)板。要特別注意材質(zhì)，標(biāo)示“Tissue Culture (TC) Treated”是養(yǎng)細(xì)胞用的。 U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時(shí)才使用。如在免疫學(xué)方面，當(dāng)做兩種不同淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，需要二者相互接觸刺激，這時(shí)一般會(huì)選用U 型板，因?yàn)榧?xì)胞會(huì)由于重力的作用而聚集在很小的范圍內(nèi)內(nèi)。圓底培養(yǎng)板還會(huì)用于同位素?fù)饺氲膶?shí)驗(yàn)，需要用細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞的培養(yǎng)，如“混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)”等。V型板常用做細(xì)胞殺傷、免疫學(xué)血凝集實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞殺傷這種實(shí)驗(yàn)也可用U 型板替代（加入細(xì)胞后，低速離心)。  
（2）Terasaki 板和普通細(xì)胞培養(yǎng)板的區(qū)別
Terasaki plate主要是用于晶體學(xué)研究，產(chǎn)品設(shè)計(jì)便于對(duì)晶體的觀察與結(jié)構(gòu)分析。有兩種 sitting 和 handing drop 兩種方法，兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的外形結(jié)構(gòu)也不同。材料上選擇crystal class polymer ，特殊的材料有利觀察晶體結(jié)構(gòu)。細(xì)胞培養(yǎng)板主要是PS 材料，材料是treated sufface，便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)與伸展。當(dāng)然還有浮游細(xì)胞的生長(zhǎng)材料，同時(shí)還有l(wèi)ow binding surface      
（3）細(xì)胞培養(yǎng)板與酶標(biāo)板的區(qū)別 
酶標(biāo)板一般要比細(xì)胞培養(yǎng)板貴，細(xì)胞板主要做細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用來(lái)測(cè)蛋白濃度；酶標(biāo)板包括包被板和反應(yīng)板，一般不用做細(xì)胞培養(yǎng)，它主要做免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測(cè)，需要更高的要求和特定的酶標(biāo)工作液。 
（4 ）常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量 
不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深，一般在2~3mm 范圍，結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量（參考下表）。若加液量過(guò)多會(huì)影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動(dòng)過(guò)程中易溢出造成污染。具體所加細(xì)胞密度依實(shí)驗(yàn)的目的不同靈活掌握。
常用的培養(yǎng)器皿

培養(yǎng)器皿	底面積（cm2）	加培養(yǎng)液量（mL）	可獲細(xì)胞量
96 孔培養(yǎng)板	0.32	0.1	105#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
24 孔培養(yǎng)板	2	1.0	5×105
12 孔培養(yǎng)板	4.5	2.0	106
6 孔培養(yǎng)板	9.6	2.5	2.5×106
4 孔培養(yǎng)板	28	5.0	7×106
3.5cm 培養(yǎng)皿	8	3.0	2.0×106
6cm 培養(yǎng)皿	21	5.0	5.2×106
9cm 培養(yǎng)皿	49	10.0	12.2×106
10cm 培養(yǎng)皿	55	10.0	13.7×106
25cm 塑料培養(yǎng)瓶	25	5.0	5.2×106
75cm 塑料培養(yǎng)瓶	75	15~30	2×107
25cm 玻璃培養(yǎng)瓶	19	4.0	3×106
100cm 玻璃培養(yǎng)瓶	37.5	10.0	6×106
250cm 玻璃培養(yǎng)瓶	78	15.0	2×107
2500cm 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶	700	100~250	2.5×108

注：各種單層生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿的細(xì)胞數(shù)，主要取決于器皿底表面積和細(xì)胞體積的大小。上表以293 細(xì)胞為例給出的可獲細(xì)胞量?jī)H作參考。   
6．如何選用細(xì)胞培養(yǎng)基
培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)**重要的條件。細(xì)胞培養(yǎng)基大致有：  
（1）合成培養(yǎng)基 
主要成分為：氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、輔助物質(zhì)（核酸降解物、氧化還原劑等）。常用的有：
①199細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種。 1950年由Morgan 等設(shè)計(jì)，除BSS 外，含有53 種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細(xì)胞培養(yǎng)、病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)等。 199 （HB）細(xì)胞培養(yǎng)基，主要應(yīng)用于Vero 細(xì)胞、地鼠腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩沖性能，能夠有效提高病毒滴度。
②BME細(xì)胞培養(yǎng)基?；A(chǔ)Eagle 培養(yǎng)基（Basal Medium Eagle），1955 年由Eagle 設(shè)計(jì)，BSS＋12 種氨基酸＋谷氨酰胺＋8種維生素。簡(jiǎn)單、便于添加，適于各種傳代細(xì)胞系和特殊研究用，在此基礎(chǔ)上改良的細(xì)胞培養(yǎng)基品種有MEM、DMEM、IMDM 等。
③MEM細(xì)胞培養(yǎng)基。低限量Eagle 培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium），1959 年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細(xì)胞單層生長(zhǎng)，是一種**基本、適用范圍**廣的培養(yǎng)基，是一種被廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要注意的是，MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基有含 Earle's 平衡鹽的類(lèi)型，也有含 Hanks'平衡鹽的類(lèi)型；有高壓滅菌型的，也有過(guò)濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類(lèi)型。生產(chǎn)和科研時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況注意選擇合適的MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基。另外，因MEM 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分所限，針對(duì)生產(chǎn)之特定細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)時(shí)，并不一定是使用效果**佳或者**經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基。
④DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種。 DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L ）。細(xì)胞生長(zhǎng)快。附著稍差的腫瘤細(xì)胞、克隆培養(yǎng)用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和DNA 轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)。例如CHO 細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)乙肝疫苗、CHO 細(xì)胞表達(dá)EPO。 
⑤IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)基。 IMDM 是由Iscove's 改良的Eagle 培養(yǎng)基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量。可用于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，以及無(wú)血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 
⑥RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基。 Moore 等人于1967 年在Roswell Park Memorial Institute 研制，針對(duì)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，BSS＋21 種氨基酸＋維生素11 種等，廣泛適于許多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，也用做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
⑦Fischer’s細(xì)胞培養(yǎng)基。用于白血病微粒細(xì)胞培養(yǎng)。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
⑧HamF10、F12 細(xì)胞培養(yǎng)基。 1963 年、1969 年由Ham 設(shè)計(jì)，含微量元素，可在血清含量低時(shí)用，適用于克隆化培養(yǎng)。F10 適用于倉(cāng)鼠、人二倍體細(xì)胞，F(xiàn)12 適用于CHO 細(xì)胞。
⑨DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基。 DMEM 和F12 細(xì)胞培養(yǎng)基按照 1:1 比例混合效果**佳，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無(wú)血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。  
（2）低血清細(xì)胞培養(yǎng)基 
主要應(yīng)用于VERO 細(xì)胞、BHK21 細(xì)胞等細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶、微載體反應(yīng)器中的培養(yǎng)。 
（3）無(wú)血清培養(yǎng)基 
是設(shè)計(jì)用來(lái)在無(wú)血清條件下促使特殊類(lèi)型的細(xì)胞生長(zhǎng)或進(jìn)行專(zhuān)門(mén)應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要添加生長(zhǎng)因子和或細(xì)胞因子，含有個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。  
（4）替代天然培養(yǎng)基 
培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。面對(duì)如此多的細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基的選用，建議：
①可以查閱相關(guān)文獻(xiàn)，或在購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞株時(shí)咨詢選用**適合細(xì)胞株的培養(yǎng)基，或購(gòu)買(mǎi)相配套的細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品。  
②許多培養(yǎng)基都適合多種細(xì)胞株的培養(yǎng)，可以采用現(xiàn)有的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。
③根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選 1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇IMDM。
④結(jié)合細(xì)胞特性及培養(yǎng)基的培養(yǎng)效能，用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、克隆形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇**佳培養(yǎng)基。 
注：目前也有不少商業(yè)化的msc培養(yǎng)基，如百恩維的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（低血清） 
7．如何維持培養(yǎng)液 p H
配好的培養(yǎng)液變堿（變紫紅）是正常的現(xiàn)象。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因?yàn)榇髿庵卸趸嫉臐舛群艿停囵B(yǎng)液中的HCO3 -被漸漸耗掉，培養(yǎng)液的pH值也逐漸升高，變成了紫紅色。如果培養(yǎng)基pH值偏堿的程度不大，可將裝培養(yǎng)液的瓶口擰松，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中一段時(shí)間，讓培養(yǎng)箱中的CO2進(jìn)入培養(yǎng)液，pH值就可以糾正。如果pH值偏離的程度很大，可以通過(guò)添加少量無(wú)菌的H Cl 或者NaOH調(diào)節(jié)pH，便可以使用。將配制好的培養(yǎng)基小劑量分裝，可以避免反復(fù)開(kāi)蓋引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高。同時(shí)因NaHCO3遇熱不穩(wěn)定，會(huì)分解釋放出CO2 ，而使培養(yǎng)基的pH升高，偏堿。因此在配置使用培養(yǎng)的過(guò)程中應(yīng)注意： 
（1）動(dòng)作迅速，不可使培養(yǎng)液長(zhǎng)時(shí)間處于較高室溫下； 
（2）配置過(guò)程中，混勻時(shí)切不可加熱。混勻后應(yīng)立即放入4°C 冰箱，待過(guò)濾時(shí)再取出； 
（3）使用完畢應(yīng)盡快將瓶口封好，放于4°C 冰箱保存。
通過(guò)在培養(yǎng)液中同時(shí)添加Hepes 也可以有效的穩(wěn)定pH 值。Hepes （羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種非離子兩性緩沖液,它在pH 7.2～7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。其**大優(yōu)點(diǎn)是在開(kāi)放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH 值。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。該緩沖液使用的終濃度為10～50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/L Hepes 便可達(dá)到緩沖能力。Hepes 的使用方法有以下兩種：
（1）Hepes 可按所需的濃度直接加入到配制的培養(yǎng)液中，再過(guò)濾除菌。每1000ml 培養(yǎng)液中加入2.38 克HEPES，溶解后用1N NaOH 調(diào)pH **7.2，過(guò)濾除菌后使用。此時(shí)HEPES 的使用濃度為10 mmol/L。
（2）配成 100x 貯存液（1 mol/L），使用前取 99mL 培養(yǎng)液加入 lmL 貯存液，**終應(yīng)用濃度仍為 10 mmol/L。1 mol/L （100x）Hepes 貯存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 雙蒸水中，用1N NaOH 調(diào)pH **7.5～8.0，然后用水定容**100mL，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（2mL/瓶），4℃或-20℃保存。 
8．血清與干細(xì)胞的培養(yǎng)
干細(xì)胞在體內(nèi)存在的量很少，處在一個(gè)個(gè)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的“niche”中，所以一旦完成分離進(jìn)入體外環(huán)境，**重要的就是保證細(xì)胞的活力不受影響，那么就必須提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。這些環(huán)境就是靠培養(yǎng)基和培養(yǎng)箱來(lái)提供了。培養(yǎng)液中**重要的莫過(guò)----血清，特別是對(duì)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)。所以為了**優(yōu)的干細(xì)胞培養(yǎng)效果，推薦選用對(duì)應(yīng)的干細(xì)胞專(zhuān)用血清。牛血清是**常用的，但是根據(jù)血清的來(lái)源不同又可以分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24 小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10－30 天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)**高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分**少，所以也成為了干細(xì)胞培養(yǎng)的**。 培養(yǎng)中如何正確的使用血清？避免不好的影響呢？
血清的濃度：對(duì)大部分的干細(xì)胞，**佳的血清濃度是10%。過(guò)高的血清濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，如果是需要高濃度的血清，培養(yǎng)的時(shí)間也不能超過(guò)兩周，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化能力下降。過(guò)低的血清會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速度下降。血清的溶解：必須在 4℃進(jìn)行，**好過(guò)夜溶解。這樣可以減少沉淀的產(chǎn)生，避免營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流式。同時(shí)也要避免血清的過(guò)濾，如果需要過(guò)濾可以和培養(yǎng)基一起過(guò)濾。細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是**常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價(jià)格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來(lái)的血清，如廠家能做到這一點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
血清的質(zhì)量，種類(lèi)及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不同批次的血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力也不同，尤其是對(duì)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。注意以下幾點(diǎn)：
（1）需要長(zhǎng)期保存的血清必須儲(chǔ)存于-20℃或-80℃低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時(shí)間切勿超過(guò)1 個(gè)月。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽选?br /> （2）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 ℃或 -80 ℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過(guò)程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20 ℃進(jìn)入37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。影響使用效果！
（3）熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體成分（complement ）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，而且還會(huì)影響血清的質(zhì)量。補(bǔ)體參與反應(yīng)有：細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強(qiáng)吞噬作用,  促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。
（4 ）切勿將血清在 37℃放置太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會(huì)破壞而影響血清質(zhì)量。
（5）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 
9．胎牛血清（F B S ）是否需要滅活
滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒害作用。胎牛血清（FBS）對(duì)許多細(xì)胞系均有促生長(zhǎng)作用，主要適用于細(xì)胞株的保藏及特殊用途的細(xì)胞株的體外培養(yǎng)。胎牛血清是取自剖腹產(chǎn)的胎牛。因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的成分**少，質(zhì)量是**高的。所以不必要滅活。 
10．細(xì)胞的細(xì)菌、真菌污染及排除
真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中**常見(jiàn)的一種，尤其在梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見(jiàn)于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹(shù)枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見(jiàn)到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但**后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。
細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物，其大小以微米（μm）計(jì)。常見(jiàn)的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見(jiàn)。一旦發(fā)生細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類(lèi)；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取 10ml 細(xì)胞懸液以 100rpm 離心5min，沉淀中加入無(wú)抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h 可得結(jié)果。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗， **后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。
細(xì)菌和真菌污染多在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且由于增生迅速，多再發(fā)生污染48h以內(nèi)就已明顯。在實(shí)驗(yàn)的**初兩天密切觀察實(shí)驗(yàn)樣品是否有污染發(fā)生，有利于及時(shí)采取措施予以補(bǔ)救或排除。培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；有細(xì)胞株留存的或可購(gòu)置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室和二氧化碳培養(yǎng)箱(若發(fā)現(xiàn)真菌污染，可在污染孔內(nèi)加入1mol/L氫氧化鈉或硫酸銅 
11．細(xì)胞培養(yǎng)污染的預(yù)防
溶液處理（具體操作方法可參考細(xì)胞培養(yǎng)污染的預(yù)防），復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采用5～10 倍于常用量的抗生素沖擊，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)可能奏效。細(xì)胞培養(yǎng)中常用的抗生素及用量見(jiàn)下表。 
                                                                      常用抗生素用量和效應(yīng)          #p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

抗生素	抗菌譜			濃度（量/mL）
	細(xì)菌	真菌	支原體
青霉素	G+			100～1000μg
鏈霉素	G-			100～1000μg
慶大霉素	G+ /G-		+	50～200μg
四環(huán)素	G+ /G-		+	10～50μg
卡那霉素	G+ /G-		+	100～1000μg
兩性霉素		+		常用2μg/mL
制霉菌素		+		常用25μg/mL

+表示效應(yīng)程度 
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。 
（1）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。 
（2）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B 推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml 。 
（3）每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 
（4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3 倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3 代。
（5）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。 
（6）重復(fù)步驟4 。 
（7）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6 代，確定污染是否以已被消除。 
12．使用胰蛋白酶時(shí)加入 E DTA的目的是什么
體外培養(yǎng)的細(xì)胞受到嚴(yán)重污染時(shí)，有時(shí)即使想盡各種辦法也難以挽回。因此，防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵。只有將預(yù)防措施貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終，才能將發(fā)生污染的可能性降到**小程度。 一般預(yù)防可從以下幾方面著手： 
（1）添加抗生素 各種抗生素性質(zhì)不同，對(duì)各種微生物的作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好（但迄今尚無(wú)對(duì)抗支原體特效抗生素）。但反復(fù)使用抗生素會(huì)使微生物產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)細(xì)胞本身也有
一定影響，因此為避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗生素，或盡可能不用抗生素處理。
（2）從物品、用品消毒滅菌著手 細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在取樣檢菌一周后確認(rèn)無(wú)菌才能使用。同時(shí)，在無(wú)菌過(guò)濾操作中，隨著濾過(guò)體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇**后過(guò)濾的液體進(jìn)行檢測(cè)。定期對(duì)二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。具體操作：75%的酒精搽拭培養(yǎng)箱后，使用可移動(dòng)的紫外燈**少消毒30min，加入高壓滅菌過(guò)的超純水于培養(yǎng)箱水槽中保持濕度。也可配制300ml 的飽和硫酸銅加3L 滅菌超純水混合成硫酸銅溶液加入水槽中。 
（3）從操作者做起 
①進(jìn)無(wú)菌室前要徹底洗手，按規(guī)定穿隔離衣。開(kāi)始操作前要用 75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。 
②操作者動(dòng)作要輕，安裝吸管帽、打開(kāi)或封閉瓶口等操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長(zhǎng)時(shí)間燒灼，以防退火；燒過(guò)的器械要冷卻后才能使用；已吸過(guò)培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)液成分如蛋白質(zhì)等燒焦后會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時(shí)會(huì)將其帶到培養(yǎng)液中；膠塞、橡皮乳頭及塑料的細(xì)胞培養(yǎng)用品過(guò)火焰是也不能時(shí)間太長(zhǎng)，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞，同時(shí)塑料細(xì)胞培養(yǎng)用品也會(huì)產(chǎn)生變形影響使用。
③使用培養(yǎng)液前不宜過(guò)早開(kāi)瓶，開(kāi)瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，避免直立，以防止下落細(xì)菌的污染。不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口，培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前勿過(guò)早暴露在空氣中。 
④操作時(shí)盡量不要談話，咳嗽以防止來(lái)自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
⑤吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)專(zhuān)管專(zhuān)用，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去，以防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物之間的交叉污染。
⑥操作完畢后應(yīng)整理好工作臺(tái)面，用消毒水浸泡的紗布擦拭臺(tái)面。
（4）防止細(xì)胞交叉污染 所有從別處轉(zhuǎn)來(lái)的或是自己所建的細(xì)胞系都要早期留有的充足的凍存儲(chǔ)備，一旦懷疑發(fā)生交叉污染，可做細(xì)胞遺傳學(xué)方面的鑒定，如發(fā)現(xiàn)原有的細(xì)胞遺傳物發(fā)生改變，可以復(fù)蘇早期凍存的細(xì)胞使用。重要細(xì)胞系（株）的傳代工作應(yīng)由兩人獨(dú)立進(jìn)行。
（5）無(wú)菌室的徹底消毒
①新潔爾滅全面徹底擦洗無(wú)菌室。使用前應(yīng)稀釋即配即用。新潔爾滅和酒精相比，**大的優(yōu)點(diǎn)是便宜，因?yàn)樾聺崰枩?500ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價(jià)格可能是新潔爾滅的幾十倍。
②甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣體對(duì)各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。甲醛價(jià)廉，熏蒸消毒時(shí)不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛。 
13．膠原酶的種類(lèi)和選型
在細(xì)胞的取材中，各種消化酶經(jīng)常用于組織的分散，在組織中取得目的細(xì)胞。例如脂肪間質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs ）、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)等。其中膠原酶是**常用的一種。
種類(lèi)：I-IV 型選擇：結(jié)締組織I，III 型；骨組織、脂肪組織I 型；軟骨組織II 型；胰島細(xì)胞IV 型。崩裂酶Dispase作用：用于增強(qiáng)膠原酶的消化能力，對(duì)細(xì)胞損傷**小。 
14．膠原酶 V S胰酶
胰蛋白酶（Trypsin ），簡(jiǎn)稱胰酶，可使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而達(dá)到細(xì)胞離散的目的，是目前應(yīng)用**為廣泛的消化劑，主要采自牛或豬的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織（如胚胎、上皮、羊膜、肝、腎等軟組織）及傳代細(xì)胞的消化，但對(duì)于纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見(jiàn)有1：125 和1：250，即一份胰酶可消化125 或250 份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1~0.25%濃度，常用0.25%，特別敏感的可以使用0.125%。胰酶的消化效果主要于pH 值、溫度、胰酶的濃度、組織塊的大小和硬度有關(guān)。胰酶作用及溶解的**佳pH 是8~9，配制胰酶溶液可將液體調(diào)**pH8 左右，充分溶解，過(guò)濾除菌，過(guò)濾后再調(diào)**pH7.4 左右。胰酶作用的**適溫度為37℃，在夏季室溫25℃以上對(duì)一般傳代細(xì)胞也能達(dá)到消化效果。一般新鮮配制的胰酶消化能力較強(qiáng)。消化時(shí)間要根據(jù)不同的情況而定，胰酶對(duì)細(xì)胞的分離效果與細(xì)胞的類(lèi)型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，溫度低，組織塊大、胰酶濃度低者，消化時(shí)間長(zhǎng)，反之則相應(yīng)減少時(shí)間。酶的濃度過(guò)大或消化時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致消化過(guò)度，對(duì)細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，被消化掉；消化時(shí)間太短，消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性，也達(dá)不到分散細(xì)胞的目的。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或 4℃保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等）、消化時(shí)的溫度（氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。在使用胰酶進(jìn)行消化時(shí)，可改變不同參數(shù)以確定出**佳消化效果。
胰酶的配置方法： 
（1）稱取胰酶：按胰酶液濃度為0.25 ％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入PBS 或D-hanks 中，低速攪拌3~4小時(shí)或者置于 4℃過(guò)夜混勻（低速很重要，機(jī)械攪拌對(duì)酶是一種沖擊，如果起沫嚴(yán)重，有可能導(dǎo)致酶的變性）。
（0）調(diào)節(jié)pH 值為7.4 左右。用注射濾器過(guò)濾除菌，因蛋白制劑不宜4℃長(zhǎng)期保存，忌反復(fù)凍融，建議分裝成小瓶（離心管）于-20℃凍存或置4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 注意事項(xiàng)：
①是否需要4℃放置過(guò)夜，取決于胰酶的純度。過(guò)去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要4℃過(guò)夜。而現(xiàn)在的胰酶純度都很高，就沒(méi)有必要4℃過(guò)夜。從理論上來(lái)說(shuō)，4℃放置過(guò)夜，給細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)，盡管過(guò)濾可以除去細(xì)菌，但除不掉其代謝產(chǎn)物。 
②如果胰酶不溶、有絮狀物，考慮可能的原因有：胰酶過(guò)期或是已經(jīng)部分變性；溶液 pH 值不對(duì)；在沒(méi)過(guò)濾之前的絮狀沉淀是正常現(xiàn)象，因胰酶多取自動(dòng)物胰腺，沉淀為組織塊，過(guò)濾后即可。
③Ca2+、Mg2+、血清和蛋白質(zhì)對(duì)胰酶的活性有一定的抑制作用，所以需用不含Ca2+、Mg2+、這些離子的BSS 如D-Hanks 或者PBS 來(lái)配制。正是這個(gè)道理，開(kāi)始消化前，需用PBS 將培養(yǎng)液沖洗干凈后方加入胰酶進(jìn)行消化，否則會(huì)大大影響胰酶的作用效果。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。
④對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可在上述配方中，加入0.02%的EDTA，將胰酶與EDTA （乙二胺四乙酸）混合來(lái)進(jìn)行消化。EDTA 可通過(guò)結(jié)合（螯合）細(xì)胞間質(zhì)中的二價(jià)陽(yáng)離子從而破壞細(xì)胞連接從而增加消化效力。但因EDTA 不能被血清中和，終止消化后，需用培養(yǎng)液或PBS 徹底沖洗培養(yǎng)瓶（板），使得更好的再次利用培養(yǎng)瓶（板），否則再培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞容易脫壁。 EDTA 在常溫下難溶于酸，微溶于水（20℃時(shí)溶解度只有 0.02g ），但在堿性溶液中溶解性較大。因此為了更快的溶解 EDTA 可采取調(diào)節(jié) PH 或者是加熱的辦法。但須注意：由于胰酶不耐高溫，因此待EDTA溶解后，溫度有所下降才能加入胰酶。如果是單獨(dú)配置 EDTA 溶液，配制后可過(guò)濾除菌，也可高溫消毒滅菌。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
膠原酶（collagenase ）是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。當(dāng)擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，用胰蛋白酶解離細(xì)胞的效果較差，這時(shí)可采用膠原酶解離細(xì)胞法。膠原酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。因此適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為**終濃度 200U/ml （約為1mg/mL ）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞專(zhuān)用膠原酶，要根據(jù)所要分離消化的組織類(lèi)型選擇膠原酶類(lèi)型。具體可見(jiàn)膠原酶的種類(lèi)和選型。膠原酶消化緩和、無(wú)須機(jī)械振蕩，因而可進(jìn)一步提高細(xì)胞成活率，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。膠原酶的配置膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制、消毒滅菌和儲(chǔ)藏。關(guān)于胰蛋白酶配置方法可見(jiàn)：胰蛋白酶消化法。
注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。鈣、鎂離子和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用，因而可用 BSS （如D-hanks 或者PBS）或含血清的培養(yǎng)液配制。 
膠原酶的使用： 
（1）將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊
（2）將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50 倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 
（3）將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內(nèi)，每隔3min 振搖一次，如能放在37℃的恒溫震蕩水浴箱中則更好。消化時(shí)間與組織的類(lèi)別很有關(guān)系，對(duì)于某些腫瘤組織或其他較致密結(jié)締組織，消化時(shí)間4~48h，對(duì)于容易消化的組織可以采用37℃震蕩消化 15~45min，也可以根據(jù)具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經(jīng)搖動(dòng)即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，可以認(rèn)為已消化充分。上皮組織經(jīng)膠原酶消化后，由于上皮細(xì)胞對(duì)此酶有耐受性，可能仍有一些細(xì)胞團(tuán)未完全分散，但成團(tuán)的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此，如無(wú)特殊需要可以不必再進(jìn)一步處理。 
（4）收集消化液（有時(shí)含個(gè)別組織塊及沒(méi)有充分消化的組織碎屑則需用 100                      目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks 液或者無(wú)血清培養(yǎng)液離心漂洗1~2 次，去除上清，加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)瓶。 
膠原酶Vs 胰蛋白酶 胰蛋白酶和膠原酶消化時(shí)間與濃度上的差異，依消化溫度而異。另外這兩種酶也可混合應(yīng)用，濃度為：胰蛋白酶0.1mg+膠原酶0.25mg/mL。兩酶相比的差別見(jiàn)表1 和表2。 
                                                       表1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別 

項(xiàng)目	胰蛋白酶	膠原酶
消化特性	適用于消化軟組織	適用于消化纖維多的組織
用量	0.01%~0.5%	0.1~0.3 mg/mL（200 U/mL）
消化時(shí)間	0.5 ~ 2h	1 ~ 12h
pH	8~9	6.5~7.0
作用強(qiáng)度	強(qiáng)烈	緩和
細(xì)胞影響	時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有影響	無(wú)大影響
血清抑活	有	無(wú)
Ca2+和Mg2+	有影響	無(wú)影響

                            表2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊（0.5~1cm3 ）時(shí)所需時(shí)間（h） 

酶種類(lèi)和用量	較硬組織			軟組織
	4℃	室溫	37℃	4℃	室溫	37℃
胰蛋白酶（0.25%）	24~48	1~6	1~2	12~24	1~2	0.5~1
膠原酶（1200 U/mL）	24	6	0.5	12	3	0.25
胰蛋白酶（0.25%）+膠原酶（200 U/mL）	12~46	12~24	4~12	12~24	6~12	1~2

 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#15．干細(xì)胞的種類(lèi)和表面標(biāo)記
通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原有：SH2、SH3、 CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干細(xì)胞，骨髓中jue大多數(shù)是HSC，BMSC 只占骨髓有核細(xì)胞的0.001%～0.01% 。因此鑒定BMSC 的方法是在骨髓的干細(xì)胞中排除HSC——BMSC：CD45-、CD34-、CD29+、 CD14+/ HSC：CD34+。
 16．間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)原理概述
間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可分化成多種組織細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。
間質(zhì)干細(xì)胞**早是從骨髓中分離得到的，正常情況下，它在骨髓中的比例非常低，僅占單核細(xì)胞的1/105 ~1/104 。骨髓中單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090 g/ml左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075~1.090 g/ml，血小板為1.030~1.035 g/ml。為此利用一種密度介于1.075~1.092 g/ml之間而近于等滲的溶液（分層液）進(jìn)行密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。
在骨髓的原代培養(yǎng)物中，除了貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)干細(xì)胞外，還混雜著一些巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、造血細(xì)胞及紅細(xì)胞等，要得到較均一的間質(zhì)干細(xì)胞，必須除去其他細(xì)胞。根據(jù)其他細(xì)胞的特性，可采用不同的方式排除它們。對(duì)于紅細(xì)胞，因其不貼壁，可通過(guò)換液除去。對(duì)于貼壁的單核巨噬細(xì)胞，可根據(jù)其黏附能力的不同，通過(guò)調(diào)整Trypsin/EDTA 的消化時(shí)間，保證間質(zhì)干細(xì)胞在短暫的作用時(shí)間內(nèi)與塑料培養(yǎng)瓶壁分離，而巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、造血細(xì)胞等仍貼附于培養(yǎng)瓶壁，從而使間質(zhì)干細(xì)胞與其他的貼壁細(xì)胞得到分離。
在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時(shí)，間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高，而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)則需要較高的細(xì)胞密度，這可能與分化時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過(guò)程中，若細(xì)胞過(guò)度融合會(huì)促進(jìn)其分化趨向，故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài)，要及時(shí)傳代。 
17．間質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化
成骨和成脂誘導(dǎo)是鑒定干細(xì)胞的一種重要的方法，也是**常用、報(bào)道見(jiàn)得**多的方法。成骨**常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導(dǎo)**常用是Oil Red O （油紅O）染色法。下面我介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。 茜素紅染色方法和原理：成骨誘導(dǎo)的過(guò)程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來(lái)，這就是我們常說(shuō)的“鈣結(jié)節(jié)”。鑒定鈣結(jié)節(jié)的染色方法常用“茜素紅”。 
步驟： 
（1）吸去誘導(dǎo)液，再PBS 洗一到兩次；
（2）加入10％中性甲醛，固定30min-60min；
（3）吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色6-10min；
（4）用PBS 洗兩次，去處殘留的染色液；
（5）加入PBS，完成染色； 
茜素紅：茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH 為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加鹽酸后變成黃色，加氫氧化鈉后則變成藍(lán)紫色。有刺激性。能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應(yīng)。染色的原理就是茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。
 Oil Red O（油紅O）染色的方法和原理：成脂肪誘導(dǎo)的過(guò)程中，細(xì)胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，**后整個(gè)細(xì)胞的胞漿中都是油滴。Oil Red O染色的方法是對(duì)油滴的染色的一種方法。 
步驟： 
（1）吸去誘導(dǎo)液，再PBS 洗一到兩次；
（2）加入10％中性甲醛，固定60min； 
（3）吸去固定液，加入現(xiàn)配和過(guò)濾后的Oil Red O 染色液，染色60min； 
（4）用PBS 洗2-5 次，去處殘留的染色液和殘?jiān)?nbsp;
（5）加入PBS，完成染色； 
Oil Red O（油紅O）：1-［2,5-二甲基-4-(2,5-二甲基苯偶氮)苯偶氮］-2 萘酚，蘇丹紅5B，溶劑紅27。紅色粉末。是一種油溶性偶氮染料。易溶于苯，溶于乙醇(呈淺黃色紅色)和丙酮。生物染色劑,淀粉凝膠電泳中作類(lèi)脂和脂肪染色。顯微技術(shù)中用作脂肪染色劑。作為脂肪細(xì)胞的染色劑的原理是使用Oil Red O 的油溶性，對(duì)其它的細(xì)胞結(jié)構(gòu)著色性差。
18．干細(xì)胞老化的表現(xiàn)和處理
干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中如果環(huán)境不適合其生長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)部分細(xì)胞的老化現(xiàn)象。這是干細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)難點(diǎn)也是經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題。 干細(xì)胞老化表現(xiàn)： 細(xì)胞胞漿內(nèi)特別是在核區(qū)附近出現(xiàn)黑色顆粒，表示細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)老化；細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，則表明該細(xì)胞已老化或者已經(jīng)開(kāi)始分化（在全部細(xì)胞中出現(xiàn)少數(shù)老化細(xì)胞是正常的）；細(xì)胞立體感逐漸消失，細(xì)胞間的間隔不清，部分細(xì)胞扁平狀，細(xì)胞的形狀趨向多樣； 貼壁性減退，出現(xiàn)一些漂浮的細(xì)胞；部分分泌強(qiáng)的細(xì)胞分泌物增多，細(xì)胞表面會(huì)比較臟；細(xì)胞增殖速度明顯下降，分裂相的細(xì)胞明顯減少。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
干細(xì)胞老化的原因和預(yù)防： 接種密度的影響：部分干細(xì)胞具有一定的分泌性能，能夠分泌一些對(duì)細(xì)胞有支持能力的因子類(lèi)物質(zhì)；所以必須維持一定的接種密度，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢，**后出現(xiàn)老化； 消化過(guò)度：消化細(xì)胞時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞的表面蛋白有較強(qiáng)的損傷，所以消化的時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，使用合適濃度和pH 值的消化酶，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞老化和分化；
合適的密度的時(shí)候就要傳代：細(xì)胞如果過(guò)密，接觸抑制作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的活力減弱并影響增殖導(dǎo)致老化；
使用合適的血清和培養(yǎng)基：不同的干細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基特別是血清的要求不同，所以使用不同的培養(yǎng)用的血清進(jìn)行篩選，尋找**適合該干細(xì)胞培養(yǎng)的血清是預(yù)防細(xì)胞老化，維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)的重要保證。
 19．細(xì)胞傳代消化過(guò)程指導(dǎo)
干細(xì)胞的培養(yǎng)中，消化傳代對(duì)細(xì)胞的影響**大，所以合適的消化操作會(huì)大大減小胰酶對(duì)干細(xì)胞的傷害。應(yīng)該仔細(xì)摸索后確定目的細(xì)胞**佳的消化時(shí)間。確保大部分細(xì)胞都能消化下來(lái)，而消化時(shí)間**少。
注意要點(diǎn)：
（1）切忌過(guò)度消化（包括胰酶濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)），會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡、分化、狀態(tài)變差，分化能力丟失。所以不熟練的操作者，寧可消化不徹底，也不能消化過(guò)度；要確保細(xì)胞不消化過(guò)度，**好在顯微鏡下觀察消化的過(guò)程。 
（2）在加入完全培養(yǎng)液終止胰酶作用前，可以在細(xì)胞培養(yǎng)瓶的左右兩側(cè)和底部輕輕拍打，使細(xì)胞脫壁懸浮。加入完全培養(yǎng)基后，再用吸管輕輕吹洗幾次培養(yǎng)瓶的底面； 
（3）細(xì)胞的差異：不同種類(lèi)的干細(xì)胞的差異很大，特別與腫瘤細(xì)胞株的差異更大，很多經(jīng)驗(yàn)不可以直接使用，要仔細(xì)摸索**佳的時(shí)間； 
（4）接種的密度不能過(guò)低，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢，甚**導(dǎo)致細(xì)胞老化，
 20．冷凍保護(hù)劑作用和選擇
冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。一般來(lái)講，只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的水或簡(jiǎn)單的鹽溶液中，并以**適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對(duì)于大多數(shù)有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無(wú)**適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～600℃/min 的冷凍速率降溫冷凍，98% 以上的細(xì)胞會(huì)死亡；而加入甘油冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時(shí)，98% 以上的細(xì)胞都可存活。 
冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類(lèi)。滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過(guò)分外滲，避免了細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類(lèi)冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大，而在4℃時(shí)，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時(shí)DMSO平衡多在4℃下進(jìn)行，一般需要40～60分鐘。 
非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假說(shuō)很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成；同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。 
不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點(diǎn)。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑（如 DMSO）在低溫下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。
 21．細(xì)胞凍存
21.1細(xì)胞懸液的制備
(1)按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；
(2)將細(xì)胞懸液以800～1000r/min 離心5min，去上清液；
(3)向細(xì)胞沉淀物中加入細(xì)胞凍存液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107個(gè)/ml ；
(4)按每管0.5-1ml 的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；
(5)在凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞名稱、代次及凍存日期等內(nèi)容。
 21.2凍存 
為保持細(xì)胞**大存活率，凍存時(shí)要遵循“慢凍快融”的原則。標(biāo)準(zhǔn)的降溫速度是1-2℃/min ，當(dāng)溫度到達(dá) -25℃，降溫速度可加快**5-10℃/min，到-80℃可直接入液氮。
分級(jí)冷凍
(1)先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），約30min；
(2)接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-10℃～-20℃），約1-2 小時(shí)；
(3)然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-70℃～-80℃），過(guò)夜；
(4)**后將凍存管投入液氮中保存。
降溫過(guò)程也可使用專(zhuān)為細(xì)胞凍存設(shè)計(jì)的程序冷凍儀，我們采用的是將凍存管放入凍存盒里，再放入-80℃過(guò)夜，由于聚氯乙烯導(dǎo)熱比較慢，所以溫度可慢慢降下來(lái)，次日可直接放入液氮罐。這樣可以保證細(xì)胞的活力不受到溫度變化速率的影響。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
 21.3注意：在使用DMSO前，不用進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。也不能使用普通的砜類(lèi)材料的過(guò)濾膜來(lái)進(jìn)行過(guò)濾。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制時(shí)**好帶手套。凍存液**好現(xiàn)用現(xiàn)配。在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí)，操作過(guò)程中**好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋，動(dòng)作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出，對(duì)皮膚造成凍傷。應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無(wú)微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價(jià)值。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后，可復(fù)蘇1～2 管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因?yàn)樵趶?fù)蘇時(shí)，需要從-196℃的液氮中取出凍存管，立即投入37～40℃溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險(xiǎn)。
22．干細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇
冷凍速率：冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷**-5℃時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷**-5～-15℃之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動(dòng)的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒(méi)有足夠的時(shí)間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet （1973）證實(shí)液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無(wú)序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。 
不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過(guò)慢時(shí)，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過(guò)一定程度時(shí)即失去活性。同時(shí)冷凍速度過(guò)慢，還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過(guò)快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及外滲，會(huì)形成較到冰晶，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對(duì)細(xì)胞存活來(lái)說(shuō)是**為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無(wú)冰晶形成或形成很小的冰晶，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷，細(xì)胞也不會(huì)在高濃度的溶質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間暴露而受損。 
不同細(xì)胞的**適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的**適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min 和200℃/min 。細(xì)胞與細(xì)胞之間的**適冷凍速率可在1.6℃～300℃/min ，故對(duì)一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，shou先需要測(cè)定其**適冷凍速率，以保證獲得**高的冷凍存活率。 
復(fù)蘇速率：冷凍保護(hù)體外培養(yǎng)物，除了必須有**佳的冷凍速率、合適的冷凍保護(hù)劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時(shí)也必須有**佳的復(fù)溫速率，這樣才能保證**后獲得**佳冷凍保存效果。 復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低凍存細(xì)胞存活率。一般來(lái)說(shuō)，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在37℃水浴中，于1-2 分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過(guò)慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時(shí)造成的細(xì)胞損傷非?？欤跇O短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。在低于-70℃的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚**終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖?*超低溫，即可使生命活動(dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)**常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。
所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降**零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過(guò)程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。
水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)shou先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過(guò)其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1-2 分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)蘇溫度變化速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。
細(xì)胞復(fù)蘇步驟和注意要點(diǎn)： 
（1）準(zhǔn)備37°C水浴和預(yù)熱到 37°C 的完全培養(yǎng)液；準(zhǔn)備好一個(gè)15ml 的離心管，同時(shí)加入9ml 的完全培養(yǎng)液； 
（2）準(zhǔn)備好這些后，將細(xì)胞從液氮中取出，放入到水浴鍋中，同時(shí)輕輕搖動(dòng)，保證細(xì)胞能夠在3min 內(nèi)完全溶解，同時(shí)應(yīng)該注意不要把凍存管的管口沒(méi)入水浴中（可能由水引起污染）。 注意要點(diǎn)：溶解的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響細(xì)胞的活力，導(dǎo)致死細(xì)胞多，細(xì)胞狀態(tài)差；如果從液氮中取出，管內(nèi)有少量液氮要先-80℃放置10-30 分鐘，使液氮完全揮發(fā)再?gòu)?fù)蘇，避免危險(xiǎn)。
（3）溶解完全的細(xì)胞要快速轉(zhuǎn)移到無(wú)菌超凈臺(tái)中，用 75％酒精棉球擦外表面。用吸管將凍存管中細(xì)胞懸液吸到15ml 的含有培養(yǎng)液的離心管中，同時(shí)用培養(yǎng)液洗2 次凍存管，一起加到離心管中吹勻，避免產(chǎn)生泡沫。 注意要點(diǎn)：細(xì)胞吸出后，用培養(yǎng)液再洗 2 次凍存管，把細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移，否則會(huì)損失細(xì)胞。吹勻時(shí)如果很多泡沫會(huì)影響細(xì)胞活力，導(dǎo)致復(fù)蘇后死細(xì)胞偏多。 
（4）250 g 離心 5 minutes；棄上清液，加入2-3ml 預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，保證細(xì)胞完全重懸。 注意要點(diǎn)：離心的作用是去除細(xì)胞凍存液中DMSO 對(duì)細(xì)胞的影響，否則會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞分化。重懸務(wù)必保證所有的細(xì)胞均勻分開(kāi)，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)或者細(xì)胞還在貼在底部，損失細(xì)胞。去除上清時(shí)，要小心（特別是使用5-10ml 移液管）避免將細(xì)胞吸走，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)損失，操作熟練的人員，可以直接倒去上清。 
（5）將重懸的細(xì)胞接種到T25 或者是T75 的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)液，再把細(xì)胞搖均勻，放入37°C 、5% CO2 培養(yǎng)箱中。注意要點(diǎn)：接種到T25 可以比較安全的復(fù)蘇，推薦新手操作。這樣必須在 24-48 小時(shí)后傳代。搖勻時(shí)要左右輕輕搖動(dòng)，保證所有的細(xì)胞能夠均勻的分布。
（6）第二天進(jìn)行換液，保證去除死細(xì)胞。正常的培養(yǎng)過(guò)程是三天進(jìn)行一次換液，如果細(xì)胞長(zhǎng)到有80-90 ％匯合進(jìn)行傳代。
注意事項(xiàng)：第二天換液可以去除死細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的影響，正常的復(fù)蘇情況下是會(huì)有少量的死細(xì)胞。細(xì)胞在80-90％匯合必須進(jìn)行傳代，否則會(huì)由于接觸抑制而導(dǎo)致細(xì)胞的狀態(tài)變差或者是消化后成團(tuán)。