一.培養(yǎng)細胞生長過程：潛伏期→指數(shù)增生期→停滯期
1.1 潛伏期(latent phase)
   細胞接種后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時,細胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形.然后細胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關。一般情況下，原代培養(yǎng)細胞貼壁速度慢,可達10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常10-30 分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期.原代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24-96 小時或更長, 連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需6-24 小時。
1.2 指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)
   這是細胞增殖**旺盛的階段，分裂相細胞增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI）表示，即細胞群中每1000 個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%，原代細胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂相指數(shù)可高達3％－5％。指數(shù)增生期的細胞活力**好時期，是進行各種實驗**佳時期，也是凍存細胞的**好時機。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3－5 天后，隨著細胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少，**后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數(shù)仍然在增多。但是，當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導致細胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。
1.3 停滯期(Stagnate phase)
   細胞數(shù)量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時細胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進行分離傳代，細胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發(fā)生死亡。
為了維持細胞的存活和生長，必須進行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)擴大培養(yǎng)。
二.細胞傳代方法
  根據(jù)細胞生長特點，傳代方法有3種
2.1懸浮生長細胞傳代
多采用離心法傳代。1000轉(zhuǎn)/分,20-30秒后去上清。沉淀細胞加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。亦有直接傳代法，即懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除1/2-1/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。本實驗采用此法。
2.2半懸浮生長細胞傳代
此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁上脫落下來，進行傳代。直接吹打?qū)Υ祟惣毎袚p傷，亦可采用酶消化法傳代。
2.3貼壁生長細胞傳代
 必須采用酶消化法。常用的消化液有0.05%~0.25%的胰蛋白酶液，0.1%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA（1:2~1:4）的混合消化液，等等
三.培養(yǎng)細胞常規(guī)檢查
細胞接種或傳代后，要定時對細胞做常規(guī)檢查，如觀察培養(yǎng)液pH（顏色變化）、清亮度（是否污染）和細胞生長狀態(tài)等，隨時掌握細胞動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)異常情況及時對癥處理。
1. 營養(yǎng)液pH值：新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液呈橙紅色（pH7.2左右），適合多數(shù)細胞生長。細胞生長旺盛、代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，營養(yǎng)液酸化變黃，pH值下降；若培養(yǎng)瓶瓶塞刷洗不潔，殘留堿性物質(zhì)，致營養(yǎng)液pH值升高，顏色變紫紅色。兩種變化均對細胞生長不利。采用5%CO2與95%空氣混合氣體，37℃條件培養(yǎng)細胞，可使培養(yǎng)液pH值在一定時間內(nèi)保持在pH7.2左右。更換營養(yǎng)液的時間可依靠營養(yǎng)物消耗而定，一般情況下，每周換液兩次，每次換半量或1/3量。
2.微生物污染及排除
  污染包括微生物污染、細菌污染、霉菌污染、支原體污染、病毒污染（參閱有關參考書）
  其排除，良好的無菌操作技術是控制污染的基礎。污染時shou先找出污染原因。針對不同原因有相應的處理方法（在此不詳述）。但目前任何處理的方法均對細胞有損傷，所以還應著重污染的預防。
  3.細胞交叉污染及排除
   由于在細胞培養(yǎng)操作過程中，多種細胞培養(yǎng)同時進行時，器材和培養(yǎng)用液混雜易導致細胞交叉污染。這種污染是細胞形態(tài)和生物學特性發(fā)生變化，某些變化不易察覺。導致細胞不純。
 防止交叉污染的措施主要有：器材做好專門標記，培養(yǎng)液公用時，吸管使用分開！
   4.化學物質(zhì)污染及排除
   主要為殘存洗滌劑、細胞殘余、解體的微生物等。鼓細胞實驗所用全部實驗器材都要嚴格清洗。
   5.健康細胞與衰老細胞
    光鏡下生長狀態(tài)良好的細胞均質(zhì)、明亮、透明度大、折光性強，相差顯微鏡下可以看清細胞的形態(tài)結構，細胞質(zhì)中有粗大的線粒體顆粒和核。在細胞衰老，機能不良時，細胞質(zhì)中常出現(xiàn)黑色顆粒、空泡或脂滴，細胞間空隙加大，細胞形態(tài)變得不規(guī)則或失去原有特性。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
四.培養(yǎng)細胞的生物學檢查和鑒定
一旦培養(yǎng)的細胞生長成為形態(tài)上單一的細胞群和細胞系（株）后，無論是使用它進行研究工作，還是做建系（株）工作，都需要全面了解這些細胞的生物學特性。檢查項目一般有以下內(nèi)容：
 4.1細胞形態(tài)描述
用相差顯微鏡觀察活細胞并攝影，主要觀察細胞形態(tài)、大小、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小及多少等。采用蓋玻片條培養(yǎng)計數(shù)和Giemsa染色法，能簡便快速地獲得細胞光鏡圖像特征與電技術結合，可獲得細胞亞顯微結構圖像
 4.2細胞定性
  用于培養(yǎng)細胞的免疫標志的定性方法有兩種：
  （1）免疫組化法 （2）透射電鏡法
4.3  細胞生長曲線
對數(shù)生長期細胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細胞懸液。一般接種7~8組，每組三瓶（亦可用孔板）。每天檢查一組，每瓶計數(shù)4次，取平均值，再累計三瓶均值，連續(xù)計數(shù)7~10天。**后用坐標紙匯出逐日細胞數(shù)，即得細胞生長曲線。細胞數(shù)量增加一倍的時間即細胞倍增時間。
4.4細胞分裂指數(shù)MI
細胞分裂指數(shù)是指1000個細胞中細胞分裂相的數(shù)目。用以表示細胞增殖的旺盛程度。具體操作請參閱有關資料
   還有細胞標記指數(shù)、細胞DNA定量、細胞周期等
 
 
五.相關的實驗技術：
 5.1 細胞計數(shù)：
（1）計數(shù)板原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。
（2）操作步驟：每小組一塊計數(shù)板，及蓋玻片
① 將計數(shù)板及蓋玻片用酒精棉球擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板，放在鏡下觀察。
② 制備細胞懸液：將細胞從培養(yǎng)板孔或培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000轉(zhuǎn)4-5分鐘，棄去上清，加入PBS**一定體積（1ML）。
③ 將細胞懸液吸出少許（10ul）（可將需計數(shù)之細胞懸液先吸取0.5ml左右放在1.5mlEp管中，再拿離超凈臺計數(shù)），滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
④計算板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。
 
 ⑤公式計算：
細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×10⁴
說明：公式中除以4，因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。
公式中乘以10⁴因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm³ 而 1ml=1000mm³
 ⑥注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新稀釋制備細胞懸液
5.2臺盼蘭染色操作步驟：   
 ① 制備細胞懸液，放入EP管中。
 ② 以1：1的體積比例在上EP管中加入0.4%臺盼蘭染液，染色2_~3分鐘。
 ③ 吸取少許（一滴即可）懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
 ④ 鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計算細胞活力。
           根據(jù)實驗需要請參閱相關方法
     懸浮細胞傳代及細胞計數(shù)
一、 細胞傳代
（一）實驗用品：
1．儀器
　   凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、
倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱；
2．器皿
　 培養(yǎng)板（6孔，96孔）、培養(yǎng)瓶、玻璃長吸管（彎頭、直頭）、載玻片、
　 槍頭tip、移液管、長滴管膠塞、15ml離心管、離心管架、廢液缸、
3．其他物品
　 微量加樣器、細胞計數(shù)板、蓋玻片、記號筆、
4．試劑
1640培養(yǎng)液、PBS等
（二）實驗目的：
掌握細胞計數(shù)及懸浮細胞傳代技術。
（三）實驗原理：見前述
（四）本實驗操作步驟：
1.準備：所有實驗操作均在無菌環(huán)境下進行，需提前30分鐘消毒環(huán)境
每小組8-9人用一操作臺。備96孔板一塊，15ml離心管數(shù)支，小平皿1塊，1.5ml Ep管一盒，長玻璃滴管，加樣器及tip等
打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋（管蓋倒放于臺上）。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入1.5mlEp管（放于塑料試管架上）備用。
2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)之K562細胞，每組一瓶。放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。
      生長狀態(tài)檢測：臺盼藍法
      取一滴滴于載玻片上，用臺盼藍染色（見方法），蓋上蓋玻片，鏡下觀察
3.觀察培養(yǎng)瓶孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出瓶中的細胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入15ml塑料離心管中。再用另一支吸管吸取PBS量約2ml，加入培養(yǎng)瓶中，輕輕吹打瓶壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管中，大約總量為10ml左右。
4.離心，設置離心機1000轉(zhuǎn)/分，1-2分鐘，沉淀即可。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
5.取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管，輕輕吹打細胞，使之均勻懸浮后轉(zhuǎn)**小平皿中待分裝，注意不要污染！
6.吸取0.5―1ML細胞懸液轉(zhuǎn)入EP管中，備計數(shù)用（10ul加計數(shù)板）。
7.細胞生長曲線觀察及細胞凍存
① 細胞生長曲線觀察
    96孔板一塊，細胞懸液分別放入96孔板孔中，每孔200ul。
  本實驗觀察四天。見96孔板的一側(cè)標記1,2,3,（代表第二、三、四天），按順序每排加6孔（即**有6孔），加三排。（注意未加懸液的空白孔要保證未污染，留作復蘇細胞培養(yǎng)用）（具體觀察方法見后）
② 細胞凍存
剩余細胞轉(zhuǎn)入凍存管中，每組一管，具體方法見凍存操作。
8.鏡下觀察細胞是否分布均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
 
 
 二、細胞計數(shù)及生長曲線測定
（一）實驗目的：
  1.能獨立的進行細胞培養(yǎng)技術操作，繪制生長曲線，了解細胞生長的發(fā)育特性。
  2.學習在科研中如何應用生長曲線
（二）實驗原理：
  生長曲線的測定（計數(shù)法）是測定細胞**生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，為培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。
  為了準確描述整個過程中的細胞數(shù)目的動態(tài)變化，需連續(xù)對細胞進行計數(shù)，通常計數(shù)7天。為精確起見，一般每次計數(shù)三平行樣品（孔或瓶）細胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。以存活細胞數(shù)對培養(yǎng)時間做圖，即生長曲線。
  生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般在對數(shù)期的1/3-1/2處加藥。細胞技術的時間和次數(shù)依實驗目的而定。
  另外，測定生長曲線的常用方法還有MTT法。
（三）實驗操作
細胞生長曲線繪制
①  每一小組（8-9人）   1 塊 96孔板
   ② 細胞懸液分孔前細胞計數(shù)數(shù)據(jù)，為**天細胞數(shù)數(shù)據(jù)
③ 傳代操作中已做。
96孔板一塊，細胞懸液分別放入96孔板孔中，每孔200ul。
  本實驗觀察四天。見96孔板的一側(cè)標記1,2,3, ,（代表第二、三、四天），按順序每排加6孔（即**有6孔），加三排。（注意未加懸液的空白孔要保證未污染，留作復蘇細胞培養(yǎng)用）
④第二天  分別吸取培養(yǎng)板中 **排中 4孔 分別計數(shù)，再將4孔細胞數(shù)平均。
記錄下數(shù)值，即為第二天細胞生長情況。
⑤第三天  重復昨天工作
⑥第四天 同 ④
 ⑦ 繪圖，了解細胞生長情況，估計細胞倍增時間
 
 
。三、哺乳動物細胞凍存與復蘇
（一）實驗目的：
（1）保存種子細胞，以便隨時取用。這是保存細胞的**主要目的。
（2）減少細胞被微生物污染的危險性。
（3）減少細胞之間交叉污染的危險性。
（4）減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。
（5）避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。
（二）實驗用品：
  1.儀器
　　凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
  2.器皿
　　吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸；
　　吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）
  3.其他物品
　 微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、移液槍。
  4.試劑
 　 培養(yǎng)液、DMSO（分析純）
  K562細胞，慢性粒細胞白血病細胞系中的一種。
（三）實驗原理：
   細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以**大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結晶對細胞造成損傷。
 
 
（四）操作步驟：所有操作均為無菌環(huán)境中，操作臺需提前三十分鐘常規(guī)消毒
1.哺乳動物細胞凍存
1.1.準備：打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。
1.2.配制凍存液：吸取9 ML培養(yǎng)液放入離心管，用移液槍吸取1ML DMSO溶液，逐滴緩慢加入離心管中。**好把離心管插在冰中。
1.3.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。
1.4.觀察培養(yǎng)瓶孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出瓶中的細胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入15ml塑料離心管中。再用另一支吸管吸取PBS量約2ml，加入培養(yǎng)瓶中，輕輕吹打瓶壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管中，大約總量為10ml左右。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
1.5.離心，設置離心機1000轉(zhuǎn)/分，1-2分鐘，沉淀即可。
1.6.取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管，輕輕吹打細胞，使之均勻懸浮。
1.7.吸取0.5-1ML細胞懸液轉(zhuǎn)入EP管中，備計數(shù)用（10ul加計數(shù)板）。
1.8.吸取1ML配制好的凍存液加入離心管，與細胞混勻后，轉(zhuǎn)入凍存管（每小組做1管）。
1.9.標注：  標明細胞種類、凍存日期，凍存人。
1.10在4℃冰箱中放置 30 分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20℃，放置30 分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80℃放置16－18 小時（或過夜）；**后放入液氮中長期保存。有條件的地方，可用凍存盒。
1.11注意事項：
（1）凍存過程需緩慢
（2）凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。
（3）細胞濃度控制在：1×10⁷－5×10⁷/ml。
（4）使用合適的細胞冷凍保護劑，以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，**常用的冷凍保護劑是DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為5－10％。但是，有些細胞系不能用DMSO作為冷凍保護劑，如人白血病細胞系HL-60。因為，DMSO 能誘導HL-60 細胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護劑，如甘油（glycele）,羥乙基淀粉等。
（5）DMSO 稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細胞液中，必須事先配制。
 
 
2.哺乳動物細胞復蘇
2.1.準備工作
① 37℃水?。ū乇愇锲罚?br /> ②準備一個內(nèi)裝5-10 ml 細胞完全培養(yǎng)液15ml離心管
③六孔板一塊（四小組可共用）
2.2.細胞復蘇操作
①帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，手持凍存管不斷搖動。觀察完全解凍后移入超凈臺。冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。
②打開凍存管，迅速將細胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻。
③1000rpm離心數(shù)分鐘，棄去上清液。
④沉淀中加入適當培養(yǎng)基，放入六孔板中37℃常規(guī)培養(yǎng)。
⑤第二天觀察生長情況。
2.3.注意事項：
①解凍操作過程動作要輕。由于冷凍保存過的細胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動作要輕。
②解凍時務必注意安全，預防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，切不可直接用手，以免凍傷。