新的美G**申請(qǐng)：定量 細(xì)胞 文化 與梯度遷移實(shí)驗(yàn)。

 

被動(dòng)和活躍的細(xì)胞遷移是生物學(xué)中的重要細(xì)胞過(guò)程。 細(xì)胞遷移在生殖，胚胎發(fā)生，干細(xì)胞生物學(xué)，傷口愈合，免疫防御，組織修復(fù)，組織再生，組織重塑和實(shí)際上在活組織和器官的所有活動(dòng)中是必需的。 惡性腫瘤的威脅演變，其中細(xì)胞能夠侵入解剖限制（惡性侵襲和轉(zhuǎn)移），鼓勵(lì)對(duì)細(xì)胞遷移機(jī)制和控制的強(qiáng)烈研究，因?yàn)檫@些是腫瘤侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵組分。 在這一*域，有利于或損害細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的因素的知識(shí)正在審查使用幾個(gè)體外模型的細(xì)胞遷移通過(guò)凝膠結(jié)構(gòu)（3）或穿越純分離的實(shí)際基底膜（4）。 通過(guò)體外屏障限定細(xì)胞遷移的常見(jiàn)定量變量是時(shí)間，阻擋層厚度/組合物，即得逞擅屏障細(xì)胞的數(shù)目，所需的細(xì)胞的細(xì)胞（5）和時(shí)間的初始和**終位置之間的距離群體侵入確定的細(xì)胞培養(yǎng)間隙（體外傷口愈合試驗(yàn)）（6）。 

這些類型的測(cè)定在藥物篩選，毒性評(píng)價(jià)和細(xì)胞生物學(xué)研究中是重要的，并且通常由研究者組裝在一起的市場(chǎng)中獨(dú)立提供的多種裝置和產(chǎn)品的自制安排來(lái)執(zhí)行。 **近，來(lái)自EMD Millipore公司的一組**人申請(qǐng)了題為“Cell Culture and Gradient Migration Assay Methods and Devices”（US 20130171682 A1）的**，其實(shí)際上增強(qiáng)和改進(jìn)了公知的“Millicellμ-遷移測(cè)定Kit“來(lái)自同一公司。

該**申請(qǐng)描述了基于形成用于培養(yǎng)和定量侵入性活動(dòng)細(xì)胞的系統(tǒng)的微流體裝置的各種組件的即用型緊湊組件。 本**引入新穎的微流體細(xì)胞培養(yǎng)溶液，其允許培養(yǎng)基沒(méi)有湍流流動(dòng)，避免細(xì)胞微環(huán)境的干擾。 該解決方案比以前使用的測(cè)定法具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，使用多培養(yǎng)室板，另外在良好限制的細(xì)胞培養(yǎng)室和觀察下特定限定的“侵入室”之間提供合適的分子梯度（參見(jiàn)圖1）。 

所提出的裝置允許使用被動(dòng)重力驅(qū)動(dòng)流（通信花瓶基礎(chǔ)）長(zhǎng)期連續(xù)灌注細(xì)胞培養(yǎng)物，并允許在顯微鏡和時(shí)間圖像記錄下在侵入室上直接細(xì)胞分析。 幀記錄后的幀允許使用計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的評(píng)估具有特定軟件的細(xì)胞的侵襲行為（見(jiàn)圖2）。 

該設(shè)備的基礎(chǔ)簡(jiǎn)單而堅(jiān)固：

1。        使用經(jīng)典的微量移液管和吸頭將具有特定添加劑的培養(yǎng)基引入孔（流動(dòng)入口）。 流入口與具有毛細(xì)管網(wǎng)格的附件孔（流出口）連通，所述毛細(xì)管網(wǎng)格策略性地抑制介質(zhì)從入口到流動(dòng)通道的流動(dòng)，并且從該通道到流出口。 通過(guò)控制前流和流速，測(cè)試的持續(xù)時(shí)間可以延長(zhǎng)（**多4**5天），一起提供細(xì)胞應(yīng)答的生理時(shí)間。 所有具有低量的培養(yǎng)基和試劑降低了研究的特定分子的成本和需要。 

2。        基質(zhì)膠，膠原蛋白，纖維蛋白或他人的凝膠狀物，含有分散細(xì)胞，在“加載頻道”，一個(gè)狹長(zhǎng)室裝（100×4×2微米（長(zhǎng)×寬×高），并行尺寸段的“流動(dòng)通道”，并通過(guò)具有約4微米寬的狹縫的“擴(kuò)散屏障”與其分開(kāi)，所有這些都設(shè)置在單個(gè)塊中.100×50μm（W×H）流動(dòng)通道從流動(dòng)入口擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)灌注屏障并且供給細(xì)胞，該流動(dòng)通道模擬體內(nèi)血液流動(dòng)。在一個(gè)具體的實(shí)例中，在本申請(qǐng)中報(bào)道，作者聲稱重力驅(qū)動(dòng)流速設(shè)定為約20μl/天，允許超過(guò)3天連續(xù)流動(dòng)實(shí)驗(yàn)，而不重新填充孔。

3。        在加載通道和流體通道之間，空腔限定更大的室，“侵入室”通過(guò)屏障與主加載通道隔開(kāi)，“侵入屏障”為細(xì)胞的被動(dòng)隨機(jī)擴(kuò)散提供一定的阻力裝載通道進(jìn)入侵入室。 這種布置允許在遷移室的末端處的測(cè)試介質(zhì)的**更新，因此在遷移屏障和擴(kuò)散屏障之間保持恒定的趨化梯度。 
總之，“侵入室”由加載通道（尺寸約為4.8×0.5×0.05mm（L×W×H））和其流路外側(cè)的擴(kuò)大形成，僅被“侵入屏障”分開(kāi)，具有4微米寬的狹縫。 在入侵屏障的相對(duì)側(cè)上存在另一個(gè)屏障，即將侵入室與流動(dòng)通道分開(kāi)的“擴(kuò)散屏障”。 

4。        將含有細(xì)胞的凝膠通過(guò)毛細(xì)管流或使用其它主動(dòng)注射裝置如微量移液管或具有**的注射器裝載到裝載通道中。 凝膠通過(guò)通道朝向通過(guò)入口屏障并排穿過(guò)的流出口流動(dòng)，填充入侵室，但保留通道中大于20微米的細(xì)胞。 

5。        在裝置溫育期間，細(xì)胞通過(guò)侵入屏障主動(dòng)遷移到侵入室中，其通過(guò)溶解在通過(guò)流動(dòng)通道循環(huán)并且通過(guò)擴(kuò)散屏障擴(kuò)散進(jìn)入凝膠的培養(yǎng)基中的分子的增加或減少的濃度激活。 

6。      侵入室的底部和頂部是透明的，這允許細(xì)胞侵襲進(jìn)程的顯微觀察和記錄在時(shí)間圈數(shù)字視頻的過(guò)程。 可以在幀之后對(duì)這些時(shí)間圈序列進(jìn)行分析，并通過(guò)測(cè)量運(yùn)動(dòng)的距離和方向來(lái)測(cè)量細(xì)胞位移。 這兩種類型對(duì)濃度**高或**低濃度的細(xì)胞位移與足夠的計(jì)算軟件如的 Image J軟件 （ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）中，加入所有正和負(fù)軌道和結(jié)果統(tǒng)計(jì)比較。 為了區(qū)分朝向從隨機(jī)遷移chemoatractant趨化性，運(yùn)動(dòng)被在x方向）單獨(dú)分析（垂直于梯度從y軸（平行于梯度）運(yùn)動(dòng)。 使用從遷移圖，從侵入屏障細(xì)胞的**終位置總遷移距離與歐幾里得距離，相對(duì)于梯度條件下計(jì)算的遷移距離也可以計(jì)算 （7） 

7。      客觀數(shù)據(jù)獲取，簡(jiǎn)單性和魯棒概念是**人要求保護(hù)的基本優(yōu)點(diǎn)，但是重要的是，它們還要求該系統(tǒng)在自動(dòng)系統(tǒng)中容易變換的適用性。 他們提出了基于相同原理的允許在單個(gè)設(shè)備中測(cè)試不同的單元和條件的多個(gè)布置。