新的美G**申請：定量 細胞 文化 與梯度遷移實驗。

 

被動和活躍的細胞遷移是生物學中的重要細胞過程。 細胞遷移在生殖，胚胎發(fā)生，干細胞生物學，傷口愈合，免疫防御，組織修復，組織再生，組織重塑和實際上在活組織和器官的所有活動中是必需的。 惡性腫瘤的威脅演變，其中細胞能夠侵入解剖限制（惡性侵襲和轉(zhuǎn)移），鼓勵對細胞遷移機制和控制的強烈研究，因為這些是腫瘤侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移的關鍵組分。 在這一*域，有利于或損害細胞運動的因素的知識正在審查使用幾個體外模型的細胞遷移通過凝膠結(jié)構（3）或穿越純分離的實際基底膜（4）。 通過體外屏障限定細胞遷移的常見定量變量是時間，阻擋層厚度/組合物，即得逞擅屏障細胞的數(shù)目，所需的細胞的細胞（5）和時間的初始和**終位置之間的距離群體侵入確定的細胞培養(yǎng)間隙（體外傷口愈合試驗）（6）。 

這些類型的測定在藥物篩選，毒性評價和細胞生物學研究中是重要的，并且通常由研究者組裝在一起的市場中獨立提供的多種裝置和產(chǎn)品的自制安排來執(zhí)行。 **近，來自EMD Millipore公司的一組**人申請了題為“Cell Culture and Gradient Migration Assay Methods and Devices”（US 20130171682 A1）的**，其實際上增強和改進了公知的“Millicellμ-遷移測定Kit“來自同一公司。

該**申請描述了基于形成用于培養(yǎng)和定量侵入性活動細胞的系統(tǒng)的微流體裝置的各種組件的即用型緊湊組件。 本**引入新穎的微流體細胞培養(yǎng)溶液，其允許培養(yǎng)基沒有湍流流動，避免細胞微環(huán)境的干擾。 該解決方案比以前使用的測定法具有明顯的優(yōu)點，使用多培養(yǎng)室板，另外在良好限制的細胞培養(yǎng)室和觀察下特定限定的“侵入室”之間提供合適的分子梯度（參見圖1）。 

所提出的裝置允許使用被動重力驅(qū)動流（通信花瓶基礎）長期連續(xù)灌注細胞培養(yǎng)物，并允許在顯微鏡和時間圖像記錄下在侵入室上直接細胞分析。 幀記錄后的幀允許使用計算機驅(qū)動的評估具有特定軟件的細胞的侵襲行為（見圖2）。 

該設備的基礎簡單而堅固：

1。        使用經(jīng)典的微量移液管和吸頭將具有特定添加劑的培養(yǎng)基引入孔（流動入口）。 流入口與具有毛細管網(wǎng)格的附件孔（流出口）連通，所述毛細管網(wǎng)格策略性地抑制介質(zhì)從入口到流動通道的流動，并且從該通道到流出口。 通過控制前流和流速，測試的持續(xù)時間可以延長（**多4**5天），一起提供細胞應答的生理時間。 所有具有低量的培養(yǎng)基和試劑降低了研究的特定分子的成本和需要。 

2。        基質(zhì)膠，膠原蛋白，纖維蛋白或他人的凝膠狀物，含有分散細胞，在“加載頻道”，一個狹長室裝（100×4×2微米（長×寬×高），并行尺寸段的“流動通道”，并通過具有約4微米寬的狹縫的“擴散屏障”與其分開，所有這些都設置在單個塊中.100×50μm（W×H）流動通道從流動入口擴散的營養(yǎng)物質(zhì)通過灌注屏障并且供給細胞，該流動通道模擬體內(nèi)血液流動。在一個具體的實例中，在本申請中報道，作者聲稱重力驅(qū)動流速設定為約20μl/天，允許超過3天連續(xù)流動實驗，而不重新填充孔。

3。        在加載通道和流體通道之間，空腔限定更大的室，“侵入室”通過屏障與主加載通道隔開，“侵入屏障”為細胞的被動隨機擴散提供一定的阻力裝載通道進入侵入室。 這種布置允許在遷移室的末端處的測試介質(zhì)的**更新，因此在遷移屏障和擴散屏障之間保持恒定的趨化梯度。 
總之，“侵入室”由加載通道（尺寸約為4.8×0.5×0.05mm（L×W×H））和其流路外側(cè)的擴大形成，僅被“侵入屏障”分開，具有4微米寬的狹縫。 在入侵屏障的相對側(cè)上存在另一個屏障，即將侵入室與流動通道分開的“擴散屏障”。 

4。        將含有細胞的凝膠通過毛細管流或使用其它主動注射裝置如微量移液管或具有**的注射器裝載到裝載通道中。 凝膠通過通道朝向通過入口屏障并排穿過的流出口流動，填充入侵室，但保留通道中大于20微米的細胞。 

5。        在裝置溫育期間，細胞通過侵入屏障主動遷移到侵入室中，其通過溶解在通過流動通道循環(huán)并且通過擴散屏障擴散進入凝膠的培養(yǎng)基中的分子的增加或減少的濃度激活。 

6。      侵入室的底部和頂部是透明的，這允許細胞侵襲進程的顯微觀察和記錄在時間圈數(shù)字視頻的過程。 可以在幀之后對這些時間圈序列進行分析，并通過測量運動的距離和方向來測量細胞位移。 這兩種類型對濃度**高或**低濃度的細胞位移與足夠的計算軟件如的 Image J軟件 （ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）中，加入所有正和負軌道和結(jié)果統(tǒng)計比較。 為了區(qū)分朝向從隨機遷移chemoatractant趨化性，運動被在x方向）單獨分析（垂直于梯度從y軸（平行于梯度）運動。 使用從遷移圖，從侵入屏障細胞的**終位置總遷移距離與歐幾里得距離，相對于梯度條件下計算的遷移距離也可以計算 （7） 

7。      客觀數(shù)據(jù)獲取，簡單性和魯棒概念是**人要求保護的基本優(yōu)點，但是重要的是，它們還要求該系統(tǒng)在自動系統(tǒng)中容易變換的適用性。 他們提出了基于相同原理的允許在單個設備中測試不同的單元和條件的多個布置。